ABSTRACT Purpose APR-246 (Eprenetapopt) is in clinical development with a focus on haematological malignancies and is marketed as a mutant-p53 reactivation therapy. Currently, the detection of at least one TP53 mutation is an inclusion criterion for patient selection into most clinical trials. Preliminary results from our phase Ib/II clinical trial investigating APR-246 combined with combination chemotherapy (cisplatin and 5-Fluorouracil) in metastatic oesophageal cancer, together with previous pre-clinical studies, indicate that TP53 mutation status alone may not be a sufficient biomarker for response to APR-246. This study aimed to identify a robust biomarker for response to APR-246. Methods Correlation analysis of the PRIMA-1 activity (lead compound to APR-246) with mutational status, gene expression, protein expression and metabolite abundance across over 800 cancer cell lines was performed. Functional validation and a boutique siRNA screen of over 750 redox-related genes were also conducted. Results TP53 mutation status was not predictive of response to APR-246. The expression of SLC7A11, the cystine/glutamate transporter, was identified as a superior determinant of response to APR-246. Genetic regulators of SLC7A11, including ATF4, MDM2, wild-type p53 and c-Myc were confirmed to also regulate cancer cell sensitivity to APR-246. Conclusions SLC7A11 expression is the major determinant of sensitivity to APR-246 and should be utilised as a predictive biomarker in future clinical investigation of APR-246.

ABSTRACT The mechanisms by which cells respond and adapt to oxidative stress are largely unknown but are key to developing a rationale for cancer therapies that target antioxidant pathways. APR-246 is a mutant-p53 targeted therapeutic currently under clinical investigation in myeloid dysplastic syndrome (MDS) and acute myeloid leukemia 1 . Whilst the mechanism of action of APR-246 is thought to be reactivation of wild-type p53 activity through covalent modification of cysteine residues in the core domain of mutant-p53 protein 2,3 , here we report that the anti-neoplastic capacity of APR-246 lies predominantly in the conjugation of free cysteine. Genome-wide CRISPR perturbation screening, metabolite profiling and proteomics in response to APR-246 treatment in mutant-p53 cancer cells highlighted the role of GSH and mitochondrial metabolism in determining APR-246 efficacy. APR-246 sensitivity was increased through loss of key enzymes in mitochondrial one-carbon metabolism, SHMT2 and MTHFD1L , due to diminished glycine supply for de novo GSH synthesis. Critically, we show that APR-246 induces iron-dependent, apoptotic machinery-independent cell death, ferroptosis. Whole-cell proteomics analyses indicated an upregulation of proteins involved in iron-sulfur cluster biogenesis (eg. FDX1). GSH, acetyl-CoA and NADH levels were also depleted in APR-246 treated cells. Importantly, we found that APR-246 inhibits iron-sulfur cluster biogenesis in the mitochondria of cancer cells through cysteine conjugation. This work not only details novel determinants of APR-246 activity in cancer cells, but also provides a clinical roadmap for targeting antioxidant pathways in tumours - beyond targeting mutant-p53 tumours.

Abstract Background Resistance to endocrine therapy is a major clinical challenge in the management of estrogen receptor (ER)-positive breast cancer. In this setting p53 is frequently wildtype and its activity may be suppressed via upregulation of its key regulator MDM2. This underlies our rationale to evaluate MDM2 inhibition as a therapeutic strategy in treatment resistant ER-positive breast cancer. Methods We used the MDM2 inhibitor NVP-CGM097 to treat in vitro and in vivo models alone and in combination with fulvestrant or palbociclib. We perform cell viability, cell cycle, apoptosis and senescence assays to evaluate antitumor effects in p53 wildtype and p53 mutant ER positive cell lines (MCF-7, ZR75-1, T-47D) and MCF-7 lines resistant to endocrine therapy and to CDK4/6 inhibition. We further assess the drug effects in patient-derived xenograft (PDX) models of endocrine-sensitive and -resistant ER positive breast cancer. Results We demonstrate that MDM2 inhibition results in cell cycle arrest and increased apoptosis in p53-wildtype in vitro and in vivo breast cancer models, leading to potent anti-tumour activity. We find that endocrine therapy or CDK4/6 inhibition synergises with MDM2 inhibition but does not further enhance apoptosis. Instead, combination treatments result in profound regulation of cell cycle-related transcriptional programmes, with synergy achieved through increased antagonism of cell cycle progression. Combination therapy pushes cell lines resistant to fulvestrant or palbociclib to become senescent and significantly reduces tumour growth in a fulvestrant resistant patient derived xenograft model. Conclusions We conclude that MDM2 inhibitors in combination with ER degraders or CDK4/6 inhibitors represent a rational strategy for treating advanced, endocrine resistant ER-positive breast cancer, operating through synergistic activation of cell cycle co-regulatory programs.