Abstract Detection of nucleic acids within sub-cellular compartments is key to understanding their function. Determining the intracellular distribution of nucleic acids requires quantitative retention and estimation of their association with different organelles by immunofluorescence microscopy. This is important also for the delivery of nucleic acid therapeutics which depends on endocytic uptake and endosomal escape. However, the current methods fail to preserve the majority of exogenously delivered nucleic acids in the cytoplasm. To solve this problem, by monitoring Cy5-labeled mRNA delivered to primary human adipocytes via lipid nanoparticles (LNP), we optimized cell fixation, permeabilization and immuno-staining of a number of organelle markers, achieving quantitative retention of mRNA and allowing visualization of levels which escape detection using conventional procedures. Additionally, we demonstrated the protocol to be effective on exogenously delivered siRNA, miRNA, as well as endogenous miRNA. Our protocol is compatible with RNA probes of single molecule fluorescence in-situ hybridization (smFISH) and molecular beacon, thus demonstrating that it is broadly applicable to study a variety of nucleic acids.

Abstract Delivery of exogenous mRNA using lipid nanoparticles (LNP) is a promising strategy for therapeutics. However, a bottleneck remains the poor understanding of the parameters that correlate with endosomal escape vs. cytotoxicity. To address this problem, we compared the endosomal distribution of six LNP-mRNA formulations of diverse chemical composition and efficacy, similar to those employed in mRNA-based vaccines, in primary human adipocytes, fibroblasts and HeLa cells. Surprisingly, we found that total uptake is not a sufficient predictor of delivery and different LNP vary considerably in endosomal distributions. Prolonged uptake impaired endosomal acidification, a sign of cytotoxicity, and caused mRNA to accumulate in compartments defective in cargo transport and unproductive for delivery. In contrast, early endocytic/recycling compartments have the highest probability for mRNA escape. By super-resolution microscopy we could resolve single LNP-mRNA within sub-endosomal compartments and capture events of mRNA escape from endosomal recycling tubules. Our results change the view of the mechanisms of endosomal escape and define quantitative parameters to guide the development of mRNA formulations towards higher efficacy and lower cytotoxicity.