ABSTRACT Microtubules (MTs) are cytoskeletal fibers that undergo dynamic instability (DI), a remarkable process involving phases of growth and shortening separated by stochastic transitions called catastrophe and rescue. Dissecting dynamic instability mechanism(s) requires first characterizing and quantifying these dynamics, a subjective process that often ignores complexity in MT behavior. We present a S tatistical T ool for A utomated D ynamic I nstability A nalysis (STADIA), which identifies and quantifies not only growth and shortening, but also a category of intermediate behaviors that we term ‘stutters.’ During stutters, the rate of MT length change tends to be smaller in magnitude than during typical growth or shortening phases. Quantifying stutters and other behaviors with STADIA demonstrates that stutters precede most catastrophes in our dimer-scale MT simulations and in vitro experiments, suggesting that stutters are mechanistically involved in catastrophes. Related to this idea, we show that the anti-catastrophe factor CLASP2γ works by promoting the return of stuttering MTs to growth. STADIA enables more comprehensive and data-driven analysis of MT dynamics compared to previous methods. The treatment of stutters as distinct and quantifiable DI behaviors provides new opportunities for analyzing mechanisms of MT dynamics and their regulation by binding proteins.

Behaviors of dynamic polymers such as microtubules and actin are frequently assessed at one or both of two scales: (i) net assembly or disassembly of bulk polymer, (ii) growth and shortening of individual filaments. Previous work has derived various forms of an equation to relate the rate of change in bulk polymer mass (i.e., flux of subunits into and out of polymer, often abbreviated as "J") to individual filament behaviors. However, these versions of this "J equation" differ in the variables used to quantify individual filament behavior, which correspond to different experimental approaches. For example, some variants of the J equation use dynamic instability parameters, obtained by following particular individuals for long periods of time. Another form of the equation uses measurements from many individuals followed over short time steps. We use a combination of derivations and computer simulations that mimic experiments to (i) relate the various forms of the J equation to each other; (ii) determine conditions under which these J equation forms are and are not equivalent; and (iii) identify aspects of the measurements that can affect the accuracy of each form of the J equation. Improved understanding of the J equation and its connections to experimentally measurable quantities will contribute to efforts to build a multi-scale understanding of steady-state polymer behavior.

The concept of critical concentration (CC) is central to understanding behaviors of microtubules and other cytoskeletal polymers. Traditionally, these polymers are understood to have one CC, measured multiple ways and assumed to be the subunit concentration necessary for polymer assembly. However, this framework does not incorporate dynamic instability (DI), and there is work indicating that microtubules have two CCs. We use our previously established simulations to confirm that microtubules have (at least) two experimentally relevant CCs and to clarify the behaviors of individuals and populations relative to the CCs. At free subunit concentrations above the lower CC (CCIndGrow), growth phases of individual filaments can occur transiently ; above the higher CC (CCPopGrow), the population’s polymer mass will increase persistently . Our results demonstrate that most experimental CC measurements correspond to CCPopGrow, meaning “typical” DI occurs below the concentration traditionally considered necessary for polymer assembly. We report that [free tubulin] at steady state does not equal CCPopGrow, but instead approaches CCPopGrow asymptotically as [total tubulin] increases and depends on the number of stable microtubule seeds. We show that the degree of separation between CCIndGrow and CCPopGrow depends on the rate of nucleotide hydrolysis. This clarified framework helps explain and unify many experimental observations.