Abstract Pdr5, a member of the extensive ABC transporter superfamily, is representative of a clinically relevant subgroup involved in pleiotropic drug resistance. Through the coupling of nucleotide hydrolysis with drug efflux, Pdr5 homologues enable pathogenic species to survive in the presence of chemically diverse antifungal agents. Our structural and functional results reveal details of an ATP-driven conformational cycle, which mechanically drives drug translocation through an amphipathic channel, and a clamping switch within a conserved linker loop that acts as a nucleotide sensor. One half of the transporter remains nearly invariant throughout the cycle, while its partner undergoes changes that are transmitted across interdomain interfaces to support a peristaltic motion of the pumped molecule. The efflux model proposed here rationalises the pleiotropic impact of Pdr5 and opens avenues for the development of effective antifungal compounds.

Abstract Pseudomonas aeruginosa is a severe threat to immunocompromised patients due to its numerous virulence factors and multiresistance against antibiotics. This bacterium produces and secretes various toxins with hydrolytic activities including phospholipases A, C and D. However, the function of intracellular phospholipases for bacterial virulence has still not been established. Here we demonstrate that the hypothetical gene pa2927 of P. aeruginosa encodes a novel phospholipase B named PaPlaB. PaPlaB isolated from detergent-solubilized membranes of E. coli rapidly degraded various GPLs including endogenous GPLs isolated from P. aeruginosa cells. Cellular localization studies suggest that PaPlaB is peripherally bound to the inner and outer membrane of E. coli , yet the active form was predominantly associated with the cytoplasmic membrane. In vitro activity of purified and detergent-stabilized PaPlaB increases at lower protein concentrations. The size distribution profile of PaPlaB oligomers revealed that decreasing protein concentration triggers oligomer dissociation. These results indicate that homooligomerisation regulates PaPlaB activity by a yet unknown mechanism, which might be required for preventing bacteria from self-disrupting the membrane. We demonstrated that PaPlaB is an important determinant of the biofilm lifestyle of P. aeruginosa , as shown by biofilm quantification assay and confocal laser scanning microscopic analysis of biofilm architecture. This novel intracellular phospholipase B with a putative virulence role contributes to our understanding of membrane GPL degrading enzymes and may provide a target for new therapeutics against P. aeruginosa biofilms.

Abstract Pseudomonas aeruginosa is a wide-spread opportunistic human pathogen and a high-risk factor for immunodeficient people and patients with cystic fibrosis. The extracellular lipase A belongs to the virulence factors of P. aeruginosa . The lipase undergoes folding and activation in the periplasm prior the secretion. Here, we demonstrate that the ubiquitous periplasmic chaperone Skp of P. aeruginosa , but not SurA, FkpA, PpiD or YfgM, efficiently prevents misfolding of the aggregation-prone lipase A and facilitates its activation by a specific foldase LipH. Small-angle X-ray scattering visualizes the trimeric architecture of P. aeruginosa Skp and identifies two primary conformations of the chaperone, a compact and a widely open. We describe two binding modes of Skp to the lipase, with affinities of 20 nM and 2 μM, which correspond to 1:1 and 1:2 stoichiometry of the lipase:Skp complex. Two Skp trimers are required to stabilize the lipase via the apolar interactions, which are not affected by high salt concentrations typical for the sputum of cystic fibrosis patients. The chaperoning effect of Skp points to its potent role in maturation and secretion of the lipase in Pseudomonas species.

Abstract Many proteins of the Repeats in Toxins (RTX) protein family are toxins of Gram-negative pathogens including hemolysin A (HlyA) of uropathogenic E. coli . RTX proteins are secreted via Type I secretion systems (T1SS) and adopt their native conformation in the Ca 2+ -rich extracellular environment. Here we employed the E. coli HlyA T1SS as a heterologous surrogate system for the RTX toxin MbxA from the bovine pathogen Moraxella bovis . In E. coli the HlyA system successfully activates the heterologous MbxA substrate by acylation and secretes the precursor proMbxA and active MbxA allowing purification of both species in quantities sufficient for a variety of investigations. The activating E. coli acyltransferase HlyC recognizes the acylation sites in MbxA, but unexpectedly in a different acylation pattern as for its endogenous substrate HlyA. HlyC-activated MbxA shows host species-independent activity including a so-far unknown toxicity against human lymphocytes and epithelial cells. Using live- cell imaging, we show an immediate MbxA-mediated permeabilization and a rapidly developing blebbing of the plasma membrane in epithelial cells, which is associated with immediate cell death.

Lanthipeptides are ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides containing dehydrated amino acids and (methyl-)lanthionine rings. One of the best-studied example is nisin, which is synthesized as a precursor peptide comprising of an N-terminal leader peptide and a C-terminal core peptide. Amongst others, the leader peptide is crucial for enzyme recognition and acts as a secretion signal for the ABC transporter NisT which secrets nisin in a proposed channeling mechanism. Here, we present an in vivo secretion analysis of this process in the presence and absence of the maturation machinery composed of the dehydratase NisB and the cyclase NisC. The data clearly demonstrated that the function of NisC, but the mere presence of NisB modulated the apparent secretion rates. Additional in vitro studies of detergent-solubilized NisT revealed how the activity of this ABC transporter is again influenced by the enzymes of the maturation machinery, but not the substrate.

Abstract Biochemical processes within the living cell occur in a highly crowded environment. The phenomenon of macromolecular crowding is not an exclusive feature of the cytoplasm and can be observed in the densely protein-packed, nonhomogeneous cellular membranes and at the membrane interfaces. Crowding affects diffusional and conformational dynamics of proteins within the lipid bilayer, and modulates the membrane organization. However, the non-invasive quantification of the membrane crowding is not trivial. Here, we developed the genetically- encoded fluorescence-based sensor for probing the macromolecular crowding at the membrane interfaces. Two sensor variants, both composed of fluorescent proteins and a membrane anchor, but differing by the flexible linker domains were characterized in vitro , and the procedures for the membrane reconstitution were established. Lateral pressure induced by membrane-tethered synthetic and protein crowders altered the sensors’ conformation, causing increase in the intramolecular Förster’s resonance energy transfer. The effect of protein crowders only weakly correlated with their molecular weight, suggesting that other factors, such as shape and charge play role in the quinary interactions. Upon their expression, the designed sensors were localized to the inner membrane of E. coli , and measurements performed in extracted membrane vesicles revealed low level of interfacial crowding. The sensors offer broad opportunities to study interfacial crowding in a complex environment of native membranes, and thus add to the toolbox of methods for studying membrane dynamics and proteostasis.

Abstract Spatiotemporal expression can be achieved by transport and translation of mRNAs at defined subcellular sites. An emerging mechanism mediating mRNA trafficking is microtubule- dependent co-transport on shuttling endosomes. Although progress has been made in identifying various components of the endosomal mRNA transport machinery, a mechanistic understanding of how these RNA-binding proteins are connected to endosomes is still lacking. Here, we demonstrate that a flexible MademoiseLLE (MLLE) domain platform within RNA- binding protein Rrm4 of Ustilago maydis is crucial for endosomal attachment. Our structure/function analysis uncovered three MLLE domains at the C-terminus of Rrm4 with a functionally defined hierarchy. MLLE3 recognises two PAM2-like sequences of the adaptor protein Upa1 and is essential for endosomal shuttling of Rrm4. MLLE1 and MLLE2 are most likely accessory domains exhibiting a variable binding mode for interaction with currently unknown partners. Thus, endosomal attachment of the mRNA transporter is orchestrated by a sophisticated MLLE domain binding platform.

Pdr5 is the most abundant ABC transporter in Saccharomyces cerevisiae and plays a major role in the pleiotropic drug resistance (PDR) network, which actively prevents cell entry of a large number of structurally unrelated compounds. Due to a high level of asymmetry in one of its nucleotide binding sites (NBS), Pdr5 serves as a perfect model system for asymmetric ABC transporter such as its medical relevant homologue Cdr1 from Candida albicans. In the past 30 years, this ABC transporter was intensively studied in vivo and in plasma membrane vesicles. Nevertheless, these studies were limited since it was not possible to isolate and reconstitute Pdr5 in a synthetic membrane system while maintaining its activity. Here, the functional reconstitution of Pdr5 in a native-like environment in an almost unidirectional inside-out orientation is described. We demonstrate that reconstituted Pdr5 is capable of translocating short-chain fluorescent NBD lipids from the outer to the inner leaflet of the proteoliposomes. Moreover, this transporter revealed its ability to utilize other nucleotides to accomplish transport of substrates in a reconstituted system. Besides, we were also able to estimate the NTPase activity of reconstituted Pdr5 and determine the kinetic parameters for ATP, GTP, CTP, and UTP.