Abstract PAX5 is the master transcription factor controlling B cell identity. In humans, mutations in PAX5 account for 30% of B cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) cases. Investigating the causal effects of PAX5 mutations has however been difficult due to the premature lethality of Pax5 −/− mice. Here we describe a novel mouse strain with a premature STOP mutation in Pax5 (Y351*) that produces a truncated protein and reduction in protein function, yet still allows for some B cell development to occur. A population of uncommitted and multipotent CD19 + B220 − B cells develops in the bone marrow of homozygous mice leading to the development of B-ALL. We show that the tumors frequently acquire secondary mutations in Jak3 , and Ptpn11 highlighting key pathways interacting with PAX5 during malignant transformation. Analysis of the PAX5 Y351* mice provide insight not only into the functional consequence of reduced PAX5 activity on B cell development and identity, but also provides an avenue in which to study PAX5-driven B-ALL in mice. One Sentence Summary Reduction in PAX5 function in mice induces the development of uncommitted B cells that have multipotent and malignant potential.

SUMMARY Dysregulated STAT3 signalling is correlated with antibody-mediated autoimmunity and B- cell neoplasia, but its effect on B cells is underexplored. Here we address this in children with STAT3 gain-of-function (GOF) syndrome and in mice with STAT3 T716M , the most common STAT3 GOF syndrome human mutation, or STAT3 K658N , a dimerization interface mutation responsible for STAT3 GOF syndrome in two children. The main B cell consequence of overactive STAT3 was accumulation of CD19 high CD21 low atypical memory B cells in humans and of CD21 low CD23 low B cells in mice resembling age-associated B cells expressing T-bet, CD11c and plasma cell differentiation genes. Overactive STAT3 within B cells increased expression of many genes in the B cell receptor and T cell help pathways, increased the tolerogenic receptor CD22, but opposed B cell tolerance checkpoints and increased formation of T-bet+ B cells upon BCR and CD40 stimulation. These results reveal overactive STAT3 as a central driver of a key class of disease- associated B-lymphocytes in humans and mice.

SUMMARY The association between cancer and autoimmune disease is unexplained, exemplified by T-cell large granular lymphocytic leukemia (T-LGL) where gain-of-function somatic mutations in STAT3 correlate with co-existing autoimmunity. To resolve whether these mutations are the cause or consequence of CD8 clonal expansions and autoimmunity, here we analyse patients with germline STAT3 GOF syndrome and mice with the T-LGL mutation STAT3 K658N or the most common germline mutation, STAT3 T716M . STAT3 GOF mutations drove accumulation of effector CD8 T cell clones highly expressing the NKG2D receptor for MHC-I-related molecules expressed on stressed cells, and the genes for inflammatory/cytotoxic granzymes, perforin, interferon-γ and Ccl5 /Rantes. CD8 cells were essential to lethal disease in Stat3 K658N mice and their accumulation required NKG2D and the receptor for IL-15 and IL-2, IL2RB. These results demonstrate that STAT3 GOF mutations cause effector CD8 T cell oligoclonal accumulation and that these rogue T cells contribute to autoimmune pathology, supporting the hypothesis that somatic mutations in leukemia/lymphoma driver genes contribute to autoimmune disease. IN BRIEF Leukemia and autoimmune-associated STAT3 gain-of-function mutations dysregulate CD8 T cells to cause autoimmune pathology and oligoclonal expansion of cytotoxic killer CD8 T cells, that depend upon NKG2D and IL2RB receptors for signals displayed on stressed, damaged, infected, or mutated tissues.

The unexplained association between infection and autoimmune disease is strongest for hepatitis C virus-induced cryoglobulinemic vasculitis (HCV-CV). We traced the evolution of the pathogenic rheumatoid factor (RhF) autoantibodies in four HCV-CV patients by deep single cell multi-omic analysis, revealing three sources of B cell somatic mutation converged to drive accumulation of a large disease causing clone. A sensitive method for quantifying low affinity binding revealed three recurring heavy/light chain combinations created by VDJ recombination bound self IgG but not viral E2 antigen. Whole genome sequencing revealed accumulation of thousands of somatic mutations, at levels comparable to CLL and normal memory B cells, but with 1-2 corresponding to driver mutations found recurrently in B cell leukemia/lymphoma. VDJ hypermutation created autoantibodies with compromised solubility. In this virus-induced autoimmune disease, infection promotes a perfect storm of somatic mutagenesis in the descendants of a single B cell.

Abstract APOE4 is the biggest genetic risk factor for Alzheimer’s disease (AD). Proteome-wide changes independent of AD brain pathology and whether these extend to APOE4 carriers irrespective of cognitive status remain unknown. To investigate APOE4-associated proteome changes in people with and without AD. Patient clinical, APOE genotype, and cerebrospinal fluid (CSF) proteome data for 735 participants was sourced from the Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) database. Participants with no cognitive impairment, mild cognitive impairment (MCI), and AD were included. Diagnosis was defined using cognitive assessments. Supervised machine learning (classification and regression trees; CART) was used for proteome profiling to identify protein signatures. Enrichment analyses for brain regions and cells and peripheral immune cells were performed using NetworkAnalyst 3.0 and the Human Protein Atlas. CART revealed an APOE4 specific proteome signature consisting of 7 proteins that were independent predictors of APOE4 carriers (sensitivity, specificity, PPV, NPV, and AUC = 1.0) and 50 proteins that interacted together for prediction (sensitivity = 0.99, specificity = 0.74, PPV = 0.86, NPV = 0.98, AUC = 0.92). This signature was found across APOE4 carriers independently of diagnosis and was associated with an increased risk of progression to cognitive impairment over time. Proteins within the signature were enriched in brain regions including the caudate and cortex. Enriched brain cells included endothelial cells, oligodendrocytes, and astrocytes. Enriched peripheral immune cells included T cells, macrophages, and B cells. We identified an APOE4 specific CSF proteome signature of 57 proteins that was independent of cognitive status and was associated with an increased risk of progression to cognitive impairment. It was also associated with a strong immune and inflammatory phenotype across the brain and periphery. Our findings suggest that the APOE4 proteome signature is independent of AD-specific brain pathology and likely underlies APOE4 carriers’ vulnerability to cognitive decline and AD.

SUMMARY CD21 low age-associated or atypical memory B cells, enriched for autoantibodies and poised for plasma cell differentiation, accumulate in large numbers in chronic infections, autoimmune disease and immunodeficiency, posing the question of what checkpoints normally oppose their excessive accumulation. Here, we reveal a critical role for the calcium-NFAT-regulated transcription factors EGR2 and EGR3. In the absence of EGR2 and EGR3 within B cells, CD21 low and B1 B cells accumulate and circulate in young mice in numbers 10-20 times greater than normal, over-express a large set of EGR2 ChIP-seq target genes including known drivers of plasma cell differentiation and under-express drivers of follicular germinal centers. Most follicular B cells constitutively express Egr2 proportionally to surface IgM down-regulation by self-antigens, and EGR2/3 deficiency abolishes this characteristic anergy response. These results define a key transcriptional checkpoint repressing CD21 low B cell formation and inform how NFATC1 or EGR2 mutations promote B1 cell-derived chronic lymphocytic leukemias.

The B-cell receptor (BCR) performs essential functions for the adaptive immune system including recognition of pathogen-derived antigens. Cell-to-cell variability of BCR sequences due to V(D)J recombination and somatic hypermutation (SHM) necessitates single-cell characterization of BCR sequences. Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) presents the opportunity for simultaneous capture of the BCR sequence and transcriptomic signature for a detailed understanding of the dynamics of an immune response. We developed VDJPuzzle 2.0, a bioinformatic tool that reconstructs productive, full-length B-cell receptor sequences of both heavy and light chains. VDJPuzzle successfully reconstructs BCRs from 98.3% (n=117) of human and 96.5% (n=200) from murine B cells. 92.0% of clonotypes and 90.3% of mutations were concordant with single-cell Sanger sequencing of the immunoglobulin chains. VDJPuzzle is available at https://bitbucket.org/kirbyvisp/vdjpuzzle2

The unexplained association between infection and autoimmune disease is strongest for hepatitis C virus-induced cryoglobulinemic vasculitis (HCV-cryovas). To analyze its origins, we traced the evolution of pathogenic rheumatoid factor (RF) autoantibodies in four HCV-cryovas patients by deep single-cell multi-omic analysis, revealing three sources of B cell somatic mutation converged to drive the accumulation of a large disease-causing clone. A method for quantifying low-affinity binding revealed recurring antibody variable domain combinations created by V(D)J recombination that bound self-immunoglobulin G (IgG) but not viral E2 antigen. Whole-genome sequencing revealed thousands of somatic mutations, numerically comparable to chronic lymphocytic leukemia and normal memory B cells, but with 1-2 corresponding to driver mutations found recurrently in B cell leukemia and lymphoma. V(D)J hypermutation created autoantibodies with compromised solubility in complex with self-IgG. In this virus-induced autoimmune disease, infection promotes a catastrophic confluence of somatic mutagenesis in the descendants of a single B cell.