Abstract Many eukaryotic organisms are diploid or even polyploid, i.e. they harbour two or more independent copies of each chromosome. Yet, to date most reference genome assemblies represent a mosaic consensus sequence in which the homologous chromosomes have been collapsed into one sequence. This procedure generates sequence artefacts and impedes analyses of allele-specific mechanisms. Here, we report the allele-specific genome assembly of the diploid unicellular protozoan parasite Trypanosoma brucei . As a first step, we called variants on the allele-collapsed assembly of the T. brucei Lister 427 isolate using short-read error-corrected PacBio reads. We identified 96 thousand heterozygote variants across the genome (average of 4.2 variants / kb), and observed that the variant density along the chromosomes was highly uneven. Several long (>100 kb) regions of loss-of-heterozigosity (LOH) were identified, suggesting recent recombination events between the alleles. By analysing available genomic sequencing data of multiple Lister 427 derived clones, we found that most LOH regions were conserved, except for some that were specific to clones adapted to the insect lifecycle stage. Surprisingly, we also found that some Lister 427 clones were aneuploid. We found evidence of trisomy in chromosome five (chr 5), chr 2, chr 6 and chr 7. Moreover, by analysing RNA-seq data, we showed that the transcript level is proportional to the ploidy, evidencing the lack of a general expression control at the transcript level in T. brucei . As a second step, to generate an allele-specific genome assembly, we used two powerful datatypes for haplotype reconstruction: raw long reads (PacBio) and chromosome conformation (Hi-C) data. With this approach, we were able to assign 99.5% of all heterozygote variants to a specific homologous chromosome, building a 66 Mb long T. brucei Lister 427 allele-specific genome assembly. Hereby, we identified genes with allele-specific premature termination codons and showed that differences in allele-specific expression at the level of transcription and translation can be accurately monitored with the fully phased genome assembly. The obtained reference-grade allele-specific genome assembly of T. brucei will enable the analysis of allele-specific phenomena, as well as the better understanding of recombination and evolutionary processes. Furthermore, it will serve as a standard to ‘benchmark’ much needed automatic genome assembly pipelines for highly heterozygous wild species isolates.

Highly selective gene expression is a key requirement for antigenic variation in several pathogens, allowing evasion of host immune responses and maintenance of persistent infections. African trypanosomes, parasites that cause lethal diseases in humans and livestock, employ an antigenic variation mechanism that involves monogenic antigen expression from a pool of >2500 antigen coding genes. In other eukaryotes, the expression of individual genes can be enhanced by mechanisms involving the juxtaposition of otherwise distal chromosomal loci in the three-dimensional nuclear space. However, trypanosomes lack classical enhancer sequences or regulated transcription initiation and the monogenic expression mechanism has remained enigmatic. Here, we show that the single expressed antigen coding gene displays a specific inter-chromosomal interaction with a major mRNA splicing locus. Chromosome conformation capture (Hi-C), revealed a dynamic reconfiguration of this inter-chromosomal interaction upon activation of another antigen. Super-resolution microscopy showed the interaction to be heritable and splicing dependent. We find that the two genomic loci are connected by the antigen exclusion complex, whereby VEX1 associated with the splicing locus and VEX2 with the antigen coding locus. Following VEX2 depletion, loss of monogenic antigen expression was accompanied by increased interactions between previously silent antigen genes and the splicing locus. Our results reveal a novel mechanism to ensure monogenic expression, requiring the spatial integration of antigen transcription and mRNA splicing in a dedicated compartment. These findings suggest a new means of post-transcriptional gene regulation.

In most organisms, ribosomal RNA (rRNA) contributes to >85% of total RNA. Thus, to obtain useful information from RNA-sequencing (RNA-seq) analyses at reasonable sequencing depth, typically, mature polyadenylated transcripts are enriched or rRNA molecules are depleted. Targeted depletion of rRNA or other highly abundant transcripts is particularly useful when studying transcripts lacking a poly(A) tail, such as some non-coding RNAs (ncRNAs), most bacterial RNAs and partially degraded or immature transcripts. While several commercially available kits allow effective rRNA depletion, their efficiency relies on a high degree of sequence homology between oligonucleotide probes and the target RNA. This restricts the use of such kits to a limited number of organisms with conserved rRNA sequences. In this study we describe the use of biotinylated oligos and streptavidin-coated paramagnetic beads for the efficient and specific depletion of trypanosomal rRNA. Our approach reduces the levels of the most abundant rRNA transcripts to less than 5% with minimal off-target effects. By adjusting the sequence of the oligonucleotide probes, our approach can be used to deplete rRNAs or other abundant transcripts independent of species. Thus, our protocol provides a useful alternative for rRNA removal where enrichment of polyadenylated transcripts is not an option and commercial kits for rRNA are not available.