Abstract Insulin receptor (Insr) protein can be found at higher levels in pancreatic β-cells than in most other tissues, but the consequences of β-cell insulin resistance remain enigmatic. Ins1 cre allele was used to delete Insr specifically in β-cells of both female and male mice. Experimental mice were compared to Ins1 cre -containing littermate controls at multiple ages and on multiple diets. RNA-seq of purified recombined β-cells revealed transcriptomic consequences of Insr loss, which differed between female and male mice. Action potential and calcium oscillation frequencies were increased in Insr knockout β- cells from female, but not male mice, whereas only male β Insr KO mice had reduced ATP-coupled oxygen consumption rate and reduced expression of genes involved in ATP synthesis. Female β Insr KO and β Insr HET mice exhibited elevated insulin release in perifusion experiments, during hyperglycemic clamps, and following i.p. glucose challenge. Deletion of Insr did not alter β-cell area up to 9 months of age, nor did it impair hyperglycemia-induced proliferation. Based on our data, we adapted a mathematical model to include β-cell insulin resistance, which predicted that β-cell Insr knockout would improve glucose tolerance depending on the degree of whole-body insulin resistance. Indeed, glucose tolerance was significantly improved in female β Insr KO and β Insr HET mice when compared to controls at 9, 21 and 39 weeks, and also in insulin-sensitive 4-week old males. We did not observe improved glucose tolerance in older male mice or in high fat diet-fed mice, corroborating the prediction that global insulin resistance obscures the effects of β-cell specific insulin resistance. The propensity for hyperinsulinemia was associated with mildly reduced fasting glucose and increased body weight. We further validated our main in vivo findings using the Ins1 -CreERT transgenic line and found that male mice had improved glucose tolerance 4 weeks after tamoxifen-mediated Insr deletion. Collectively, our data show that loss of β-cell Insr contributes to glucose-induced hyperinsulinemia, thereby improving glucose homeostasis in otherwise insulin sensitive dietary and age contexts.

The Sxy (TfoX) protein is required for expression of a distinct subset of the genes regulated by the cAMP receptor protein (CRP) in the model organisms Escherichia coli, Haemophilus influenzae, and Vibrio cholerae. Genetic studies have established that CRP and Sxy co-activate transcription at gene promoters containing DNA binding sites called CRP-S sites. In contrast, CRP acts without Sxy at gene promoters containing canonical CRP-N sites, suggesting that Sxy makes physical contacts with CRP and/or DNA to assist in transcriptional activation at CRP-S promoters. Despite growing interest in Sxy's activity as a transcription factor, Sxy remains poorly characterized due to a lack of reliable phenotypes in E. coli. Experiments are further hampered by growth inhibition and formation of inclusion bodies when Sxy is overexpressed. In this study we applied diverse phenotypic and molecular assays to test for postulated Sxy functions and interactions. Mutations in conserved regions of Sxy and truncations in the Sxy C-terminus abolish transcriptional activation of a CRP-S promoter, and a 37 amino acid truncation of the C-terminus relieves the growth inhibition normally caused by Sxy overexpression. Sxy was unable to augment weakened CRP interactions to restore carbon metabolism phenotypes. Bandshift analysis and chromatin pull-down assays of Sxy-CRP-DNA interactions yielded intriguing evidence of CRP-Sxy and Sxy-DNA physical interactions. However, despite the careful application of standard protein purification protocols and quality control steps for nickel affinity column purification, protein mass spectrometry revealed the enrichment of additional DNA-binding proteins in nickel column eluates, presenting a probable source of artefactual protein-protein and protein-DNA interaction results. These findings highlight the importance of extensive controls and phenotypic assays for the study of poorly characterized and recalcitrant proteins like Sxy.

Dietary supplementation of the clinical PI3K inhibitor alpelisib (Piqray) extends the lifespan of male and female mice and is associated with greater strength and balance but reduced bone mass and mild hyperglycaemia.

Natural competence allows bacteria to respond to environmental and nutritional cues by taking up free DNA from their surroundings, thus gaining nutrients and genetic information. In the Gram-negative bacterium Haemophilus influenae, the DNA uptake machinery is induced by the CRP and Sxy transcription factors in response to lack of preferred carbon sources and nucleotide precursors. Here we show that HI0659 - which is absolutely required for DNA uptake - encodes the antitoxin of a competence-regulated toxin-antitoxin operon (toxTA), likely acquired by horizontal gene transfer from a Streptococcus species. Deletion of the toxin restores uptake to the antitoxin mutant. In addition to the expected Sxy- and CRP-dependent-competence promoter, transcript analysis using RNA-seq identified an internal antitoxin-repressed promoter whose transcription starts within toxT and will yield nonfunctional protein. We present evidence that the most likely effect of unopposed toxin expression is non-specific cleavage of mRNAs and arrest or death of competent cells in the culture, and we show that the toxin gene has been inactivated by deletion in many H. influenzae strains. We suggest that this competence-regulated toxin-antitoxin system may facilitate downregulation of protein synthesis and recycling of nucleotides under starvation conditions, or alternatively be a simple genetic parasite.

ABSTRACT Natural competence allows bacteria to respond to environmental and nutritional cues by taking up free DNA from their surroundings, thus gaining both nutrients and genetic information. In the Gram-negative bacterium Haemophilus influenzae , the genes needed for DNA uptake are induced by the CRP and Sxy transcription factors in response to lack of preferred carbon sources and nucleotide precursors. Here we show that one of these genes, HI0659 , encodes the antitoxin of a competence-regulated toxin-antitoxin operon (‘ toxTA’ ), likely acquired by horizontal gene transfer from a Streptococcus species. Deletion of the putative toxin (HI0660) restores uptake to the antitoxin mutant. The full toxTA operon was present in only 17 of the 181 strains we examined; complete deletion was seen in 22 strains and deletions removing parts of the toxin gene in 142 others. In addition to the expected Sxy-and CRP-dependent-competence promoter, HI0659/660 transcript analysis using RNA-seq identified an internal antitoxin-repressed promoter whose transcription starts within toxT and will yield nonfunctional protein. We propose that the most likely effect of unopposed toxin expression is non-specific cleavage of mRNAs and arrest or death of competent cells in the culture. Although the high frequency of toxT and toxTA deletions suggests that this competence-regulated toxin-antitoxin system may be mildly deleterious, it could also facilitate downregulation of protein synthesis and recycling of nucleotides under starvation conditions. Although our analyses were focused on the effects of toxTA , the RNA-seq dataset will be a useful resource for further investigations into competence regulation. ABBREVIATED SUMMARY The competence regulon of Haemophilus influenzae includes an unprecedented toxin/antitoxin gene pair. When not opposed by antitoxin, the toxin completely prevents DNA uptake but causes only very minor decreases in cell growth and competence gene expression. The TA gene pair was acquired by horizontal gene transfer, and the toxin gene has undergone repeated deletions in other strains.