Abstract Various mechanisms controlling ribosome scanning and initiation have been identified within the 5’ untranslated region (UTR) of eukaryotic genes, including upstream open reading frames, specific sequence motifs, and secondary structures. We describe the impact and distinct characteristics of a translation regulatory element consisting of a start codon immediately followed by a stop codon. While to date this start-stop element has been described only for specific cases, we identified them in the 5’UTR of hundreds of human genes whereby their general impact on translation control in mammalian cells has been unnoticed. We show that the element is evolutionarily conserved and represses translation of the downstream open reading frames. While having no apparent impact on translation termination or RNA stability, start-stops efficiently halt ribosomes and act as a barrier for the scanning of the small ribosomal subunit. Start-stop element occurs in many transcription factors and key signaling genes, and we highlight routes in which they can affect cellular fate. We investigate the start-stop element in several genes, i.e. MORF4L1 , IFNAR1 , SLC39A1 , and PSPC1 , and delineate the role of the start-stop in translation regulation of ATF4 mRNA. Thus, start-stops uniquely modulate translation through elongation-less ribosome stalling.

Abstract Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a fatal adult neurodegenerative disease characterized by proteostasis dysregulation, resulting in progressive loss of spinal and upper motor neurons. A subset of cranial motor neurons resistant to ALS-stress survive until late stages of the disease. To investigate these differences, we exploited a unique platform of induced cranial and spinal motor neurons (iCrMNs and iSpMNs, respectively). Exposing both cell types to proteotoxic stress, we quantified transcriptome and proteome changes over 36 hours for a core set of >8,200 genes. While mRNA and protein changes under stress were congruent for many genes, cell-type specific differences manifested at either the RNA or protein level, but less at both. At the protein level, iCrMNs and iSpMNs differed significantly with respect to abundance of many membrane proteins, including synaptic proteins, solute carriers, adhesion molecules, and signaling molecules suggesting that the superior stress survival of iCrMNs involve diverse pathways supporting neuronal function. Other differences included genes involved in ribosome biogenesis and subunits of the core proteasome. We investigated the role of proteasomal degradation in more detail. Our data showed that although stress reduces proteasome activity in both neuronal types, iCrMNs had significantly more abundant and active 26S proteasome than iSpMNs, which indicate a higher capacity for the degradation of ubiquitinated proteins. We identified a new regulator of this better performance, i.e. the nuclear proteasome activator Ublcp1, whose inhibition sensitized iCrMNs, but not iSpMNs, to stress and abolished their higher survival rates. The results suggest that the two neuronal cell types regulate and use the degradation machinery differently under normal and stress conditions. Overall, this work demonstrates the value of unbiased system-wide analyses in generating hypotheses on differential proteostasis regulation in cranial and spinal motor neurons.

The mammalian response to endoplasmic reticulum (ER) stress dynamically affects all layers of gene expression regulation. We quantified transcript and protein abundance along with footprints of ribosomes and non-ribosomal proteins for thousands of genes in cervical cancer cells responding to treatment with tunicamycin or hydrogen peroxide over an eight hour time course. We identify shared and stress-specific significant regulatory events at the transcriptional and post-transcriptional level and at different phases of the experiment. ER stress regulators increase transcription and translation at different times supporting an adaptive response. ER stress also induces translation of genes from serine biosynthesis and one-carbon metabolism indicating a shift in energy production. Discordant regulation of DNA repair genes suggests transcriptional priming in which delayed translation fine-tunes the early change in the transcriptome. Finally, case studies on stress-dependent alternative splicing and protein-mRNA binding demonstrate the ability of this resource to generate hypotheses for new regulatory mechanisms.

In amyotrophic lateral sclerosis (ALS) spinal motor neurons (SpMN) progressively degenerate while a subset of cranial motor neurons (CrMN) are spared until late stages of the disease. Using a rapid and efficient protocol to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to SpMNs and CrMNs, we now report that ESC-derived CrMNs accumulate less human (h)SOD1 and insoluble p62 than SpMNs over time. ESC-derived CrMNs have higher proteasome activity to degrade misfolded proteins and are intrinsically more resistant to chemically-induced proteostatic stress than SpMNs. Chemical and genetic activation of the proteasome rescues SpMN sensitivity to proteostatic stress. In agreement, the hSOD1 G93A mouse model reveals that ALS-resistant CrMNs accumulate less insoluble hSOD1 and p62-containing inclusions than SpMNs. Primary-derived ALS-resistant CrMNs are also more resistant than SpMNs to proteostatic stress. Thus, an ESC-based platform has identified a superior capacity to maintain a healthy proteome as a possible mechanism to resist ALS-induced neurodegeneration.

Abstract The serological response to the influenza virus vaccine is highly heterogeneous for reasons that are not entirely clear. While the impact of demographic factors such as age, body mass index (BMI), sex, prior vaccination and titer levels are known to impact seroconversion, they only explain a fraction of the response. To identify signatures of the vaccine response, we quantified 273 proteins from serum samples of 160 flu vaccine recipients (2019-2020 season). We found that levels of proteins functioning in cholesterol transport were positively associated with seroconversion, likely linking to the known impact of BMI. When adjusting seroconversion for the demographic factors, we identified additional, unexpected signatures: proteins regulating actin cytoskeleton dynamics were significantly elevated in participants with high adjusted seroconversion. Viral strain specific analysis showed that this trend was largely driven by the H3N2 strain. Further, we identified complex associations between adjusted seroconversion and other factors: levels of proteins of the complement system associated positively with adjusted seroconversion in younger participants, while they were associated negatively in the older population. We observed the opposite trends for proteins of high density lipoprotein remodeling, transcription, and hemostasis. In sum, careful integrative modeling can extract new signatures of seroconversion from highly variable data that suggest links between the humoral response as well as immune cell communication and migration.

Abstract The COVID-19 pandemic, triggered by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, has affected millions of people worldwide. Much research has been dedicated to our understanding of COVID-19 disease heterogeneity and severity, but less is known about recovery associated changes. To address this gap in knowledge, we quantified the proteome from serum samples from 29 COVID-19 convalescents and 29 age-, race-, and sex-matched healthy controls. Samples were acquired within the first months of the pandemic. Many proteins from pathways known to change during acute COVID-19 illness, such as from the complement cascade, coagulation system, inflammation and adaptive immune system, had returned to levels seen in healthy controls. In comparison, we identified 22 and 15 proteins with significantly elevated and lowered levels, respectively, amongst COVID-19 convalescents compared to healthy controls. Some of the changes were similar to those observed for the acute phase of the disease, i.e. elevated levels of proteins from hemolysis, the adaptive immune systems, and inflammation. In contrast, some alterations opposed those in the acute phase, e.g. elevated levels of CETP and APOA1 which function in lipid/cholesterol metabolism, and decreased levels of proteins from the complement cascade (e.g. C1R, C1S, and VWF), the coagulation system (e.g. THBS1 and VWF), and the regulation of the actin cytoskeleton (e.g. PFN1 and CFL1) amongst COVID-19 convalescents. We speculate that some of these shifts might originate from a transient decrease in platelet counts upon recovery from the disease. Finally, we observed race-specific changes, e.g. with respect to immunoglobulins and proteins related to cholesterol metabolism.

Distinguishing between Zika and dengue virus infections is critical for treatment and anticipation of complications. However, existing biomarkers have high error rates. To identify new potential diagnostic signatures, we used next-generation proteomics to profile 122 serum samples from 62 Zika or dengue patients. We quantified >500 proteins and identified 26 proteins that were significantly differentially expressed. These proteins typically function in infection and wound healing, with several also linked to pregnancy and brain. Integrating machine learning approaches, we used 7 proteins to predict ZIKV infection correctly in 72% of the cases, outperforming other tools. The three most predictive proteins were Platelet Factor 4 Variant 1, Fibrinogen Alpha, and Gelsolin. Finally, we showed that temporal changes in protein signatures from the same patient can disambiguate some diagnoses and serve as indicators for past infections. Taken together, we demonstrate that serum proteomics can be highly valuable to diagnose even challenging samples.

Post-translational modifications by the Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) are essential for diverse cellular functions. Large-scale experiment and sequence-based predictions have identified thousands of SUMOylated proteins. However, the overlap between the datasets is small, suggesting many false positives with low functional relevance. Therefore, we integrated ~800 sequence features and protein characteristics such as cellular function and protein-protein interactions in a machine learning approach to score likely functional SUMOylation events (iSUMO). iSUMO is trained on a total of 24 large-scale datasets, and it predicts 2,291 and 706 SUMO targets in human and yeast, respectively. These estimates are five times higher than what existing sequence-based tools predict at the same 5% false positive rate. Protein-protein and protein-nucleic acid interactions are highly predictive of protein SUMOylation, supporting a role of the modification in protein complex formation. We note the marked prevalence of SUMOylation amongst RNA-binding proteins. We validdate iSUMO predictions by experimental or other evidence. iSUMO therefore represents a comprehensive tool to identify high-confidence, functional SUMOylation events for human and yeast.