Abstract The development of a tractable small animal model faithfully reproducing human COVID-19 pathogenesis would arguably meet a pressing need in biomedical research. Thus far, most investigators have used transgenic mice expressing the human ACE2 in epithelial cells (K18-hACE2 transgenic mice) that are intranasally instilled with a liquid SARS-CoV-2 suspension under deep anesthesia. Unfortunately, this experimental approach results in disproportionate high CNS infection leading to fatal encephalitis, which is rarely observed in humans and severely limits this model’s usefulness. Here, we describe the use of an inhalation tower system that allows exposure of unanesthetized mice to aerosolized virus under controlled conditions. Aerosol exposure of K18-hACE2 transgenic mice to SARS-CoV-2 resulted in robust viral replication in the respiratory tract, anosmia, and airway obstruction, but did not lead to fatal viral neuroinvasion. When compared to intranasal inoculation, aerosol infection resulted in a more pronounced lung pathology including increased immune infiltration, fibrin deposition and a transcriptional signature comparable to that observed in SARS-CoV-2- infected patients. This model may prove useful for studies of viral transmission, disease pathogenesis (including long-term consequences of SARS-CoV-2 infection) and therapeutic interventions.

Abstract The COVID-19 pandemic caused by the β-coronavirus SARS-CoV-2 has made the development of safe and effective vaccines a critical global priority. To date, four vaccines have already been approved by European and American authorities for preventing COVID-19 but the development of additional vaccine platforms with improved supply and logistics profiles remains a pressing need. Here we report the preclinical evaluation of a novel COVID-19 vaccine candidate based on the electroporation of engineered, synthetic cDNA encoding a viral antigen in the skeletal muscle, a technology previously utilized for cancer vaccines. We constructed a set of prototype DNA vaccines expressing various forms of the SARS-CoV-2 Spike (S) protein and assessed their immunogenicity in animal models. Among them, COVID- e Vax – a DNA plasmid encoding a secreted monomeric form of SARS-CoV-2 S protein RBD – induced the most potent anti-SARS-CoV-2 neutralizing antibody responses (including against the current most common variants of concern) and a robust T cell response. Upon challenge with SARS-CoV-2, immunized K18-hACE2 transgenic mice showed reduced weight loss, improved pulmonary function and significantly lower viral replication in the lungs and brain. COVID- e Vax conferred significant protection to ferrets upon SARS-CoV-2 challenge. In summary, this study identifies COVID- e Vax as an ideal COVID-19 vaccine candidate suitable for clinical development. Accordingly, a combined phase I-II trial has recently started in Italy.

Abstract T DC are hematopoietic cells that combine dendritic cell (DC) and conventional T cell markers and functional properties. They were identified in secondary lymphoid organs (SLOs) of naïve mice as cells expressing CD11c, major histocompatibility molecule (MHC)-II, and the T cell receptor (TCR) β chain. Despite thorough characterization as to their potential functional properties, a physiological role for T DC remains to be determined. Unfortunately, using CD11c as a marker for T DC has the caveat of its upregulation on different cells, including T cells, upon activation. Therefore, a more specific marker is needed to further investigate T DC functions in peripheral organs in different pathological settings. Here we took advantage of Zbtb46-GFP reporter mice to explore the frequency and localization of T DC in peripheral tissues at steady state and upon viral infection. RNA sequencing analysis confirmed that T DC identified with this reporter model have a gene signature that is distinct from conventional T cells and DC. In addition, frequency and total numbers of T DC in the SLOs recapitulated those found using CD11c as a marker. This reporter model allowed for identification of T DC in situ not only in SLOs but also in the liver and lung of naïve mice. Interestingly, we found that T DC numbers in the SLOs increased upon viral infection, suggesting that T DC might play a role during viral infections. In conclusion, we propose a visualization strategy that might shed light on the physiological role of T DC in several pathological contexts, including infection and cancer.

Abstract T follicular helper (Tfh) cells are essential for the development of germinal center B cells and high-affinity antibody producing B-cells in human and mice. Here, we identify the guanine nucleotide exchange factor (GEF) Rin-like (Rinl) as a negative regulator of Tfh generation. Loss of Rinl leads to an increase of Tfh in aging, upon in vivo immunization and acute LCMV Armstrong infection in mice, and in human CD4 + T cell in vitro cultures. Further, adoptive transfer experiments using WT and Rinl-KO naïve CD4 + T cells unraveled T cell-intrinsic functions of Rinl. Mechanistically, Rinl regulates CD28 internalization and signaling, thereby shaping CD4 + T cell activation and differentiation. Thus, our results identify the GEF Rinl as a negative regulator of global Tfh differentiation in an immunological context and species-independent manner, and furthermore connect Rinl with CD28 internalization and signaling pathways in CD4 + T cells, demonstrating for the first-time the importance of endocytic processes for Tfh differentiation. Highlights Rinl-KO CD4 + T cells show increased Tfh differentiation in a context independent manner The regulation of Tfh differentiation is T cell-intrinsic Rinl controls CD28 endocytosis and shapes Tfh-specific CD28 signal transduction Human Tfh differentiation is regulated by Rinl

CD4+ T cells play a critical role in supporting antiviral humoral and cellular immune responses. Although these responses often coexist, one can sometimes dominate at the expense of the other. For instance, lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) induces a strong cellular immune response but generates a suboptimal neutralizing antibody (nAb) response, hindering viral clearance and enabling persistent infection. Recent findings indicate that this skewed preference toward cellular immunity is determined already during the differentiation of CD4+ T cells. Specifically, subcutaneous (s.c.) LCMV infection predominantly induces T-bet+ T helper 1 (TH1) differentiation while largely neglecting T follicular helper (TFH) differentiation, a key driver of humoral immunity. Here, we investigated the mechanisms responsible for this impaired TFH differentiation. We found that T-bet+ cells induced by s.c. LCMV infection are heterogeneous and encompass a terminally differentiated TH1 subset expressing Granzyme-B (GzmB) and a Tcf-1+ subset that retains the potential for TFH differentiation but that does not express CXCR5 and other mature TFH markers. Interestingly, T cell-derived IFN-γ facilitated the proliferation of the GzmB+ subset and inhibited Tcf-1+ cells' progression into TFH. The suppression of TFH cells by IFN-γ was not directly mediated through CD4+ T cells but rather involved another cell type, likely dendritic cells. Consistently, inhibition of IFN-γ enabled robust TFH differentiation, formation of germinal centers and increased antibody production. Our study provides novel insights into the mechanisms inhibiting nAb production in response to viruses and lays a foundation for the development of advanced vaccine strategies.