Double-stranded RNA-mediated interference (RNAi) has recently emerged as a powerful reverse genetic tool to silence gene expression in multiple organisms including plants, Caenorhabditis elegans , and Drosophila . The discovery that synthetic double-stranded, 21-nt small interfering RNA triggers gene-specific silencing in mammalian cells has further expanded the utility of RNAi into mammalian systems. Here we report a technology that allows synthesis of small interfering RNAs from DNA templates in vivo to efficiently inhibit endogenous gene expression. Significantly, we were able to use this approach to demonstrate, in multiple cell lines, robust inhibition of several endogenous genes of diverse functions. These findings highlight the general utility of this DNA vector-based RNAi technology in suppressing gene expression in mammalian cells.

A progressive loss of neurons with age underlies a variety of debilitating neurological disorders, including Alzheimer's disease (AD) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS), yet few effective treatments are currently available. The SIR2 gene promotes longevity in a variety of organisms and may underlie the health benefits of caloric restriction, a diet that delays aging and neurodegeneration in mammals. Here, we report that a human homologue of SIR2, SIRT1, is upregulated in mouse models for AD, ALS and in primary neurons challenged with neurotoxic insults. In cell-based models for AD/tauopathies and ALS, SIRT1 and resveratrol, a SIRT1-activating molecule, both promote neuronal survival. In the inducible p25 transgenic mouse, a model of AD and tauopathies, resveratrol reduced neurodegeneration in the hippocampus, prevented learning impairment, and decreased the acetylation of the known SIRT1 substrates PGC-1alpha and p53. Furthermore, injection of SIRT1 lentivirus in the hippocampus of p25 transgenic mice conferred significant protection against neurodegeneration. Thus, SIRT1 constitutes a unique molecular link between aging and human neurodegenerative disorders and provides a promising avenue for therapeutic intervention.

Yin Yang 1 (YY1) is a transcription factor that plays an essential role in development. However, the full spectrum of YY1's functions and mechanism of action remains unclear. We find that YY1 ablation results in p53 accumulation due to a reduction of p53 ubiquitination in vivo. Conversely, YY1 overexpression stimulates p53 ubiquitination and degradation. Significantly, recombinant YY1 is sufficient to induce Hdm2-mediated p53 polyubiquitination in vitro, suggesting that this function of YY1 is independent of its transcriptional activity. We identify direct physical interactions of YY1 with Hdm2 and p53 and show that the basis for YY1-regulating p53 ubiquitination is its ability to facilitate Hdm2-p53 interaction. Importantly, the tumor suppressor p14ARF compromises the Hdm2-YY1 interaction, which is important for YY1 regulation of p53. Taken together, these findings identify YY1 as a potential cofactor for Hdm2 in the regulation of p53 homeostasis and suggest a possible role for YY1 in tumorigenesis.

An iron efflux pump is a pivotal protein in breast cancer biology and a strong and independent predictor of breast cancer prognosis.

The candidate tumor suppressor BAP1 is a deubiquitinating enzyme (DUB) involved in the regulation of cell proliferation, although the molecular mechanisms governing its function remain poorly defined. BAP1 was recently shown to interact with and deubiquitinate the transcriptional regulator host cell factor 1 (HCF-1). Here we show that BAP1 assembles multiprotein complexes containing numerous transcription factors and cofactors, including HCF-1 and the transcription factor Yin Yang 1 (YY1). Through its coiled-coil motif, BAP1 directly interacts with the zinc fingers of YY1. Moreover, HCF-1 interacts with the middle region of YY1 encompassing the glycine-lysine-rich domain and is essential for the formation of a ternary complex with YY1 and BAP1 in vivo. BAP1 activates transcription in an enzymatic-activity-dependent manner and regulates the expression of a variety of genes involved in numerous cellular processes. We further show that BAP1 and HCF-1 are recruited by YY1 to the promoter of the cox7c gene, which encodes a mitochondrial protein used here as a model of BAP1-activated gene expression. Our findings (i) establish a direct link between BAP1 and the transcriptional control of genes regulating cell growth and proliferation and (ii) shed light on a novel mechanism of transcription regulation involving ubiquitin signaling.

In prostate cancer (PCa), the common treatment involving androgen ablation alleviates the disease temporarily, but results in the recurrence of highly aggressive and androgen-independent metastatic cancer. Therefore, more effective therapeutic approaches are needed. It is known that aberrant epigenetics contributes to prostate malignancy. Unlike genetic changes, these epigenetic alterations are reversible, which makes them attractive targets in PCa therapy to impede cancer progression. As a histone methyltransferase, Ezh2 plays an essential role in epigenetic regulation. Since Ezh2 is overexpressed and acts as an oncogene in PCa, it has been proposed as a bona fide target of PCa therapy. MicroRNAs (miRNAs) regulate gene expression through modulating protein translation. Recently, the contribution of miRNAs in cancer development is increasingly appreciated. In this report, we present our study showing that microRNA-101 (miR-101) inhibits Ezh2 expression and differentially regulates prostate cancer cells. In addition, the expression of miR-101 alters upon androgen treatment and HIF-1alpha/HIF-1beta induction.In our reporter assays, both miR-101 and miR-26a inhibit the expression of a reporter construct containing the 3'-UTR of Ezh2. When ectopically expressed in PC-3, DU145 and LNCaP cells, miR-101 inhibits endogenous Ezh2 expression in all three cell lines, while miR-26a only decreases Ezh2 in DU145. Ectopic miR-101 reduces the invasion ability of PC-3 cells, while restored Ezh2 expression rescues the invasiveness of PC-3 cells. Similarly, miR-101 also inhibits cell invasion and migration of DU145 and LNCaP cells, respectively. Interestingly, ectopic miR-101 exhibits differential effects on the proliferation of PC-3, DU-145 and LNCaP cells and also causes morphological changes of LNCaP cells. In addition, the expression of miR-101 is regulated by androgen receptor and HIF-1alpha/HIF-1beta. While HIF-1alpha/HIF-1beta induced by deferoxamine mesylate (DFO) decreases miR-101 levels, the overall effects of R-1881 on miR-101 expression are stimulatory.This study indicates that miR-101 targets Ezh2 and decreases the invasiveness of PCa cells, suggesting that miR-101 introduction is a potential therapeutic strategy to combat PCa. MiR-101 differentially regulates prostate cell proliferation. Meanwhile, the expression of miR-101 is also modulated at different physiological conditions, such as androgen stimulation and HIF-1alpha/HIF-1beta induction.

ABSTRACT As an oncogenic transcription factor, Yin Yang 1 (YY1) regulates enhancer and promoter connection. However, gaps still exist in understanding how YY1 coordinates coactivators and chromatin elements to assemble super-enhancers. Here, we demonstrate that YY1 activates FOXM1 gene expression through forming liquid-liquid phase separation to compartmentalize both coactivators and enhancer elements. In the transactivation domain of YY1, a histidine cluster is essential for its activities of forming phase separation, which can be extended to additional proteins. Coactivators EP300, BRD4, MED1 and active RNA polymerase II are components of YY1-rich nuclear puncta. Consistently, histone markers for gene activation, but not repression, colocalize with YY1. Importantly, multiple enhancer elements and the FOXM1 promoter are bridged by YY1 to form super-enhancers. These studies propose that YY1 is a general transcriptional activator, and promotes phase separation with incorporation of major coactivators and stabilization by distal enhancers to activate target gene expression.

Lung adenocarcinoma (LUAD) is the leading cause of cancer-related death worldwide, but the underlying molecular mechanisms remain largely unclear. The transcription factor (TF) specificity protein 1 (SP1) plays a crucial role in the development of various cancers, including LUAD. Recent studies have indicated that master TFs may form phase-separated macromolecular condensates to promote super-enhancer (SE) assembly and oncogene expression. In this study, we demonstrated that SP1 undergoes phase separation and that its zinc finger 3 in the DNA-binding domain is essential for this process. Through Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease (CUT&RUN) using antibodies against SP1 and H3K27ac, we found a significant correlation between SP1 enrichment and SE elements, identified the regulator of the G protein signaling 20 (RGS20) gene as the most likely target regulated by SP1 through SE mechanisms, and verified this finding using different approaches. The oncogenic activity of SP1 relies on its phase separation ability and RGS20 gene activation, which can be abolished by glycogen synthase kinase J4 (GSK-J4), a demethylase inhibitor. Together, our findings provide evidence that SP1 regulates its target oncogene expression through phase separation and SE mechanisms, thereby promoting LUAD cell progression. This study also revealed an innovative target for LUAD therapies through intervening in SP1-mediated SE formation.