ABSTRACT ISG15 is an interferon-stimulated, ubiquitin-like protein that can conjugate to substrate proteins (ISGylation) to counteract microbial infection, but the underlying mechanisms remain elusive. Here, we used a viral-like particle trapping technology to identify ISG15-binding proteins and discovered Ring Finger Protein 213 (RNF213) as an ISG15 interactor and cellular sensor of ISGylated proteins. RNF213 is a poorly-characterized, interferon-induced megaprotein that is frequently mutated in Moyamoya disease, a rare cerebrovascular disorder. We found that interferon induces ISGylation and oligomerization of RNF213 on lipid droplets, where it acts as a sensor for ISGylated proteins. We showed that RNF213 has broad antimicrobial activity in vitro and in vivo, counteracting infection with Listeria monocytogenes, herpes simplex virus 1 (HSV-1), human respiratory syncytial virus (RSV) and coxsackievirus B3 (CVB3), and we observed a striking co-localization of RNF213 with intracellular bacteria. Together, our findings provide novel molecular insights into the ISGylation pathway and reveal RNF213 as a key antimicrobial effector.

Listeria monocytogenes is a foodborne intracellular bacterial model pathogen. Protective immunity against Listeria depends on an effective CD8

ABSTRACT Listeria monocytogenes is a foodborne intracellular bacterial pathogen leading to human listeriosis. Despite a high mortality rate and increasing antibiotic resistance no clinically approved vaccine against Listeria is available. Attenuated Listeria strains offer protection and are tested as antitumor vaccine vectors, but would benefit from a better knowledge on immunodominant vector antigens. To identify novel antigens, we screened for Listeria epitopes presented on the surface of infected human cell lines by mass spectrometry-based immunopeptidomics. In between more than 15,000 human self-peptides, we detected 68 Listeria epitopes from 42 different bacterial proteins, including several known antigens. Peptide epitopes presented on different cell lines were often derived from the same bacterial surface proteins, classifying these antigens as potential vaccine candidates. Encoding these highly presented antigens in lipid nanoparticle mRNA vaccine formulations resulted in specific CD8+ T-cell responses and high levels of protection in vaccination challenge experiments in mice. Our results pave the way for the development of a clinical mRNA vaccine against Listeria and aid to improve attenuated Listeria vaccines and vectors, demonstrating the power of immunopeptidomics for next-generation bacterial vaccine development.