Significance Idiopathic pulmonary fibrosis and emphysema are leading causes of mortality, but there are no effective therapies. Mutations in telomerase are the most common identifiable risk factor for idiopathic pulmonary fibrosis. They also predispose to severe emphysema in smokers, occurring at a frequency similar to α-1 antitrypsin deficiency. The work shown here points to alveolar stem cell senescence as a driver of these pathologies. Epithelial stem cell failure was associated with secondary inflammatory recruitment and exquisite susceptibility to injury from “second hits.” The findings suggest that efforts to reverse the stem cell failure state directly, rather than its secondary consequences, may be an effective therapy approach in telomere-mediated lung disease.

Significance This study defines clinical indications for using telomere length (TL) measurement as a diagnostic tool in a hospital setting. It shows that, in contrast to other methods, TL measurement by flow cytometry and FISH (flowFISH) can be standardized, and has reproducible and definable upper and lower normal boundaries. In telomerase mutation carriers and carriers of other mutant telomere maintenance genes, TL had prognostic value, correlating with the age of onset of short telomere syndrome phenotypes, as well as the predominant complication. In a prospective study, TL results were actionable in one-fourth of cases with idiopathic bone marrow failure affecting the stem cell donor choice and/or treatment regimen. The data show that, for targeted clinical indications, and in a hospital setting, TL measurement by flowFISH informs patient care decisions.

Abstract Photosynthesis is compromised in most plants because an enzymatic side-reaction fixes O 2 instead of CO 2 . The energetic cost of oxygenation led to the evolution of C 4 photosynthesis. In almost all C 4 leaves compartmentation of photosynthesis between cells reduces oxygenation and so increases photosynthetic efficiency. Here we report that spatial expression of most C 4 genes is controlled by intragenic cis -elements rather than promoter sequence. Two DNA motifs that cooperatively specify the patterning of genes required for C 4 photosynthesis are identified. They are conserved in plants and algae that use the ancestral C 3 pathway. As these motifs are located in exons they represent duons determining both gene expression and amino acid sequence. Our findings provide functional evidence for the importance of transcription factors recognising coding sequence as previously defined by genome-wide binding studies. Furthermore, they indicate that C 4 evolution is based on ancient DNA motifs found in exonic sequence.

Abstract C 4 photosynthesis is used by the most productive plants on the planet, and compared with the ancestral C 3 pathway, it confers a 50% increase in efficiency 1 . In more than 60 C 4 lineages, CO 2 fixation is compartmentalized between tissues, and bundle-sheath cells become photosynthetically activated 2 . How the bundle sheath acquires this alternate identity that allows efficient photosynthesis is unclear. Here we show that changes to bundle-sheath gene expression in C 4 leaves are associated with the gain of a pre-existing cis -code found in the C 3 leaf. From single-nucleus gene-expression and chromatin-accessibility atlases, we uncover DNA binding with one finger (DOF) motifs that define bundle-sheath identity in the major crops C 3 rice and C 4 sorghum. Photosynthesis genes that are rewired to be strongly expressed in the bundle-sheath cells of C 4 sorghum acquire cis -elements that are recognized by DOFs. Our findings are consistent with a simple model in which C 4 photosynthesis is based on the recruitment of an ancestral cis -code associated with bundle-sheath identity. Gain of such elements harnessed a stable patterning of transcription factors between cell types that are found in both C 3 and C 4 leaves to activate photosynthesis in the bundle sheath. Our findings provide molecular insights into the evolution of the complex C 4 pathway, and might also guide the rational engineering of C 4 photosynthesis in C 3 crops to improve crop productivity and resilience 3,4 .

The C4 pathway has evolved in over sixty lineages of plants and improves photosynthetic efficiency by ~50%. One unifying character of C4 plants is photosynthetic activation of a compartment such as the bundle sheath, but gene regulatory networks controlling this cell type are poorly understood. For example, in Arabidopsis thaliana a bipartite MYC-MYB transcription factor module restricts gene expression to this cell type but in grasses the regulatory logic allowing bundle sheath gene expression has not been defined. Using the global staple and C3 crop rice we identified the SULFITE REDUCTASE promoter as sufficient for strong expression in this cell type. This promoter encodes an intricate cis-regulatory logic with multiple activators and repressors acting in a combinatorial manner. However, within this landscape we identified a distal enhancer comprising a module activated by quartet of transcription factors from the G2-like, MYB-related, IDD and bZIP families. This module is necessary and sufficient to pattern gene expression to the rice bundle sheath, and oligomerisation allowed activity to be increased 23-fold. In summary, we identify a short tunable enhancer patterning expression to the rice bundle sheath that we anticipate will be useful for engineering this cell type. The transcription factor module responsible for this patterning is distinct from that previously reported in A. thaliana.

Abstract In the leaves of C 3 species such as rice, mesophyll cells contain the largest compartment of photosynthetically active chloroplasts. In contrast, plants that use the derived and more efficient C 4 photosynthetic pathway have a significant chloroplast compartment in both bundle sheath and mesophyll cells. Accordingly, the evolution of C 4 photosynthesis from the ancestral C 3 state requires an increase in the chloroplast compartment of the bundle sheath. Here we investigated the potential to increase chloroplast compartment size in rice bundle sheath cells by manipulating brassinosteroid signalling. Treatment with brassinazole, a brassinosteroid biosynthesis inhibitor, increased leaf chlorophyll content and increased the number but decreased the area of chloroplasts in bundle sheath cells. Constitutive overexpression of the BRASSINAZOLE RESISTANT 1 ( OsBZR1 ) transcription factor increased bundle sheath chloroplast area by up to 45% but plants became chlorotic. However, when OsBZR1 was placed under the control of a bundle sheath specific promoter, the negative effects on growth and viability were removed whilst chloroplast area still increased. In summary, we report a role for brassinosteroids in controlling chloroplast area and number in rice and conclude that cell-specific manipulation of brassinosteroid signalling can be used to manipulate the chloroplast compartment in rice bundle sheath cells.

Very short telomere length (TL) provokes cellular senescence in vitro, but the clinical utility of TL measurement in a hospital-based setting has not been determined. We tested the diagnostic and prognostic value of TL measurement by flow cytometry and fluorescence in situ hybridization (flowFISH) in individuals with mutations in telomerase and telomere maintenance genes, and examined prospectively whether TL altered treatment decisions for patients with bone marrow failure. TL had a definable normal range across populations with discrete lower and upper boundaries. TL above the 50th age-adjusted percentile had a 100% negative predictive value for clinically relevant mutations in telomere maintenance genes, but the lower threshold for diagnosis was age-dependent. The extent of deviation from the age-adjusted median correlated with the age at diagnosis of a telomere syndrome as well as the predominant complication. Mild short telomere defects manifested in adults as pulmonary fibrosis-emphysema, while severely short TL manifested in children as bone marrow failure and immunodeficiency. Among 38 newly diagnosed patients with bone marrow failure, TL shorter than the 1st age-adjusted percentile enriched for patients with germline mutations in inherited bone marrow failure genes, such as RUNX1, in addition to telomere maintenance genes. The TL result modified the hematopoietic stem cell donor choice and/or treatment regimen in one-fourth of the cases (9 of 38, 24%). TL testing by flowFISH has diagnostic and predictive value in definable clinical settings. In patients with bone marrow failure, it altered treatment decisions for a significant subset.