ABSTRACT Microalgae can tolerate a wide range of environmental conditions and have been exploited for their lipid and carbohydrate accumulating properties. The utility of this process could be further enhanced through understanding the critical gene regulatory networks that govern the acclimatization process. Advancements in systems biology and sequencing tools now enable us to obtain a genome-wide overview of gene expression under particular conditions of interest. Under salinity stress, Microchloropsis gaditana CCMP526, a commercially important alga has been previously reported to accumulate carbohydrate and lipid. To understand the mechanism of acclimatization, here we report a temporal transcriptomic analysis of M. gaditana under two different salinity levels (55 and 100 PSU). The short term (0, 1 and 6 h) and long term (24 and 72 h) responses of the salt-induced transcript pool were used to identify salinity-inducible genes using correspondence analysis. The transcript abundance of genes involved in triacylglycerol biosynthesis, membrane lipid modification, carbon assimilation and shunting, and osmolyte biosynthesis indicated that M. gaditana employs a two-stage acclimatization strategy during hypersaline conditions.

Abstract Carbohydrate hydrolysing enzymes assume special industrial and commercial interest as a source for yielding fermentable glucose especially for the biofuel industry. Among these enzymes, the exo-β-(1,3) glucanases are promising for industrial use as they hydrolyze sugars such as laminarin, a major constituent of the algal cell wall. Exploring the structure and function of these enzymes is of particular interest for the improvement of their functional properties for industrial use. We report the structural and biochemical characterizations of Aspergillus oryzae exo-β-(1,3) glucanase (AoBgl). We have expressed, purified, and performed biochemical characterizations of the recombinant AoBgl. Purified AoBgl is found to hydrolyse β-(1,3)-glycosidic linkages present in the oligosaccharide laminaritriose and the polysaccharide, laminarin effectively while retaining >50% activity at glucose concentrations of around 1.5M. We have determined three high-resolution structures of AoBgl: (a) apo form at 1.75 Å, (b) complexed form with bound disaccharide at 1.73 Å and (c) glucose-bound form at 1.20 Å. Sequence analysis and structural comparison indicate that AoBgl belongs to the GH5 sugar hydrolase family. The sugar-bound structures reveal the mode of substrate binding and interactions at the active site of AoBgl. Further, molecular dynamics simulation and mutational studies indicate that AoBgl can effectively bind trisaccharides and higher oligosaccharides. Our biochemical and structural data provide detailed molecular insights into the active site of this GH5 enzyme and would be helpful in the rational engineering of glycosyl hydrolases belonging to similar families for industrial use.

Cylindrical column with packed stationary phase is the workhorse of liquid chromatography systems. The stationary phases are commonly classified on the basis of different form factors namely, beads and monoliths for protein chromatography. Monolithic rods are one of the important geometries derived from polymers through complex polymerization schemes with additional requirements such as cross-linkers and specific reaction conditions. To address these practical difficulties and enable ease of fabrication at laboratory scale, acrylic copolymers are hypothesized to perform as a monolithic stationary phase suitable for protein chromatography. The present work proposes a rapid fabrication technique to obtain monolithic rods that could be reconditioned without any of the above additional steps. It is characterized with monolith diameter that could be controlled using acrylic copolymer concentration. Formation of the copolymeric stationary phase inside microchannel led to annular geometry and in turn, demonstrated fabrication of moon-shaped channels (MSCs) for the first time in literature. An online monitoring system facilitated tracer breakthrough analysis with MSCs to report sharp peak front and an estimate of channel void volume. Breakthrough curves with single protein validated the selection of blue dextran as tracer and indicated retention of proteins due to electrostatic interactions on the functional copolymer surface.

Salinity is one of the significant factors that affect growth and cellular metabolism, including photosynthesis and lipid accumulation, in microalgae and higher plants. Microchloropsis gaditana CCMP526 can acclimatize to different salinity levels by accumulating compatible solutes, carbohydrates, and lipids as an energy storage molecule. We used proteomics to understand the molecular basis for acclimation of M. gaditana to increased salinity levels (55 and 100 PSU (Practical Salinity Unit). Correspondence analysis (CA) was used for the identification of salinity-responsive proteins (SRPs). The highest number of altered proteins was observed in 100 PSU. Gene Ontology (GO) enrichment analysis revealed a separate path of acclimation for cells exposed to 55 and 100 PSU. Osmolyte and lipid biosynthesis was up-regulated in high saline conditions. However, concomitantly lipid oxidation pathways were also up-regulated at high saline conditions, providing acetyl-CoA for energy metabolism through the TCA cycle. Carbon fixation and photosynthesis were tightly regulated, while chlorophyll biosynthesis was affected under high salinity conditions. Importantly, temporal proteome analysis of salinity-challenged M. gaditana revealed vital salinity-responsive proteins which could be used for strain engineering for improved salinity resistance.

Identification of driver mutations can lead to a better understanding of the molecular mechanisms associated with cancer. This can be a first step towards developing diagnostic and prognostic markers. Various driver mutation prediction tools rely on different algorithm for prediction and hence there is little consensus in the predictions. The input and output formats vary across the tools. It has been suggested that an ensemble approach that takes into account various prediction scores might perform better. There is a need for a tool that can run multiple such tools on a dataset in a more accessible and modular manner, whose output can then be combined to select consensus drivers. We developed wrappers for various driver mutation predictions tools using Galaxy based framework. In order to perform predictions using multiple tools on the same dataset, we also developed Galaxy based workflows to convert VCF format to tool specific formats. The tools are publicly available at: https://github.com/saketkc/galaxy_tools The workflows are available at: https://github.com/saketkc/galaxy_tools/tree/master/workflows

Bioethanol, a sustainable alternative to fossil fuels, is produced from cellulose via enzymatic saccharification. β-Glucosidase, a key enzyme in this process, hydrolyses disaccharides into glucose but is limited by feedback inhibition. This study investigated GH1 β-glucosidase from a soil metagenome (UnBGl1) to understand and overcome this limitation. We solved the near-atomic resolution crystal structure of UnBGl1 at 1.15 Å as an apo enzyme and report the first high-resolution crystal structures of the enzyme in its pre-hydrolytic state as a cellobiose complex and covalent intermediate-bound state, capturing key stages of its catalytic mechanism. Structural analysis revealed three crucial glucose-binding subsites in UnBGl1's crater. Glucose binding at the -1 subsite induced a 1.4 Å shift in E370, increasing the distance between catalytic glutamates and reducing enzymatic activity. The C188V variant, generated by rational engineering, significantly improved glucose tolerance to 2.5 M. Additionally, the H261W mutation at the +2 subsite enhanced kinetic properties by improving cellobiose affinity ( K m = 22.87 ± 1.1 mM) and shifted the optimal pH to 5.5 from 6.0. Comparative structural analysis with other glucose-tolerant GH1 β-glucosidases revealed conserved residues at the -1 subsite crucial for substrate stabilization and +1 subsite residues interacting with glucose, offering targets for further optimization. Engineered UnBGl1 variants retained high stability and activity on sugarcane bagasse, demonstrating their potential for industrial cellulase cocktails. These findings provide a robust framework for engineering β-glucosidases with enhanced glucose tolerance and catalytic efficiency, paving the way for improved bioethanol production and contributing to sustainable energy solutions.