Article25 January 2013Open Access TET2 and TET3 regulate GlcNAcylation and H3K4 methylation through OGT and SET1/COMPASS Rachel Deplus Rachel Deplus Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Benjamin Delatte Benjamin Delatte Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Marie K Schwinn Marie K Schwinn Promega Corporation, Madison, WI, USA Search for more papers by this author Matthieu Defrance Matthieu Defrance Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Jacqui Méndez Jacqui Méndez Promega Corporation, Madison, WI, USA Search for more papers by this author Nancy Murphy Nancy Murphy Promega Corporation, Madison, WI, USA Search for more papers by this author Mark A Dawson Mark A Dawson Department of Haematology, Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge, UK Department of Pathology, Gurdon Institute, University of Cambridge, Cambridge, UK Search for more papers by this author Michael Volkmar Michael Volkmar Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Pascale Putmans Pascale Putmans Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Emilie Calonne Emilie Calonne Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Alan H Shih Alan H Shih Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, USA Search for more papers by this author Ross L Levine Ross L Levine Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, USA Search for more papers by this author Olivier Bernard Olivier Bernard INSERM UMR 985, Institut Gustave Roussy, Université Paris XI, Villejuif, France Search for more papers by this author Thomas Mercher Thomas Mercher INSERM UMR 985, Institut Gustave Roussy, Université Paris XI, Villejuif, France Search for more papers by this author Eric Solary Eric Solary INSERM UMR 1009, Institut Gustave Roussy, Université Paris XI, Villejuif, France Search for more papers by this author Marjeta Urh Marjeta Urh Promega Corporation, Madison, WI, USA Search for more papers by this author Danette L Daniels Corresponding Author Danette L Daniels Promega Corporation, Madison, WI, USA Search for more papers by this author François Fuks Corresponding Author François Fuks Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Rachel Deplus Rachel Deplus Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Benjamin Delatte Benjamin Delatte Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Marie K Schwinn Marie K Schwinn Promega Corporation, Madison, WI, USA Search for more papers by this author Matthieu Defrance Matthieu Defrance Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Jacqui Méndez Jacqui Méndez Promega Corporation, Madison, WI, USA Search for more papers by this author Nancy Murphy Nancy Murphy Promega Corporation, Madison, WI, USA Search for more papers by this author Mark A Dawson Mark A Dawson Department of Haematology, Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge, UK Department of Pathology, Gurdon Institute, University of Cambridge, Cambridge, UK Search for more papers by this author Michael Volkmar Michael Volkmar Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Pascale Putmans Pascale Putmans Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Emilie Calonne Emilie Calonne Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Alan H Shih Alan H Shih Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, USA Search for more papers by this author Ross L Levine Ross L Levine Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, USA Search for more papers by this author Olivier Bernard Olivier Bernard INSERM UMR 985, Institut Gustave Roussy, Université Paris XI, Villejuif, France Search for more papers by this author Thomas Mercher Thomas Mercher INSERM UMR 985, Institut Gustave Roussy, Université Paris XI, Villejuif, France Search for more papers by this author Eric Solary Eric Solary INSERM UMR 1009, Institut Gustave Roussy, Université Paris XI, Villejuif, France Search for more papers by this author Marjeta Urh Marjeta Urh Promega Corporation, Madison, WI, USA Search for more papers by this author Danette L Daniels Corresponding Author Danette L Daniels Promega Corporation, Madison, WI, USA Search for more papers by this author François Fuks Corresponding Author François Fuks Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Author Information Rachel Deplus1,‡, Benjamin Delatte1,‡, Marie K Schwinn2,‡, Matthieu Defrance1, Jacqui Méndez2, Nancy Murphy2, Mark A Dawson3,4, Michael Volkmar1, Pascale Putmans1, Emilie Calonne1, Alan H Shih5, Ross L Levine5, Olivier Bernard6, Thomas Mercher6, Eric Solary7, Marjeta Urh2, Danette L Daniels 2 and François Fuks 1 1Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium 2Promega Corporation, Madison, WI, USA 3Department of Haematology, Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge, UK 4Department of Pathology, Gurdon Institute, University of Cambridge, Cambridge, UK 5Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, USA 6INSERM UMR 985, Institut Gustave Roussy, Université Paris XI, Villejuif, France 7INSERM UMR 1009, Institut Gustave Roussy, Université Paris XI, Villejuif, France ‡These authors contributed equally to this work *Corresponding authors. Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53703, USA. Tel.:+1 608 274 4330; Fax:+1 608 277 2601; E-mail: [email protected] of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, 808 Route de Lennik, Brussels 1070, Belgium. Tel.:+32 2 555 62 45; Fax:+32 2 555 62 57; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2013)32:645-655https://doi.org/10.1038/emboj.2012.357 There is a Have you seen? (March 2013) associated with this Article. PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info TET proteins convert 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine, an emerging dynamic epigenetic state of DNA that can influence transcription. Evidence has linked TET1 function to epigenetic repression complexes, yet mechanistic information, especially for the TET2 and TET3 proteins, remains limited. Here, we show a direct interaction of TET2 and TET3 with O-GlcNAc transferase (OGT). OGT does not appear to influence hmC activity, rather TET2 and TET3 promote OGT activity. TET2/3–OGT co-localize on chromatin at active promoters enriched for H3K4me3 and reduction of either TET2/3 or OGT activity results in a direct decrease in H3K4me3 and concomitant decreased transcription. Further, we show that Host Cell Factor 1 (HCF1), a component of the H3K4 methyltransferase SET1/COMPASS complex, is a specific GlcNAcylation target of TET2/3–OGT, and modification of HCF1 is important for the integrity of SET1/COMPASS. Additionally, we find both TET proteins and OGT activity promote binding of the SET1/COMPASS H3K4 methyltransferase, SETD1A, to chromatin. Finally, studies in Tet2 knockout mouse bone marrow tissue extend and support the data as decreases are observed of global GlcNAcylation and also of H3K4me3, notably at several key regulators of haematopoiesis. Together, our results unveil a step-wise model, involving TET–OGT interactions, promotion of GlcNAcylation, and influence on H3K4me3 via SET1/COMPASS, highlighting a novel means by which TETs may induce transcriptional activation. Introduction Epigenetic marking of the genome and regulation of chromatin are central to establishing tissue-specific gene expression programs, and hence to several biological processes (Bonasio et al, 2010). Until recently, the only known epigenetic mark on DNA was 5-methylcytosine (mC), established and propagated by DNA methyltransferases, and generally associated with gene repression (Suzuki and Bird, 2008; Cedar and Bergman, 2009; Ndlovu et al, 2011). The discovery of cystosine 5-hydroxymethylation (hmC), and of the Ten-Eleven Translocation family of enzymes (TET1, TET2, and TET3) that catalyse the conversion of mC to hmC has sparked great interest in uncovering the roles played by this mark and these proteins (Kriaucionis and Heintz, 2009; Tahiliani et al, 2009; Ito et al, 2010). Genome-wide profiling of the distribution of Tet1 and hmC in mouse ES cells has shown that both are important in regulation of pluripotency and cellular differentiation (Ficz et al, 2011; Pastor et al, 2011; Williams et al, 2011; Wu et al, 2011). Other data have linked TET1 to epigenetic repression complexes, notably SIN3A and PRC2 (Williams et al, 2011; Wu et al, 2011). Regarding TET2 and TET3, mouse Tet2 has been implicated in haematopoiesis and human TET2 mutations have been found in various leukaemias (Langemeijer et al, 2009), while studies in mouse germ cells have shown the importance of Tet3 in epigenetic reprogramming (Gu et al, 2011). However the mode of action, particularly of the TET2 and TET3 family members, is still poorly understood. Results TET2 and TET3 associate with the O-GlcNAc transferase OGT To aid in this understanding and further explore binding partners of these proteins, we performed an unbiased proteomic approach using HaloTag technology as previously described (Los et al, 2008; Daniels et al, 2012). To this end, we expressed the full-length TET1, TET2, and TET3 proteins as HaloTag (HT) fusions in HEK293T cells, covalently captured them on an HT affinity resin, eluted the interacting proteins, and purified these for mass spectrometry (LC/MS/MS) and spectral counting analysis (Materials and methods; Supplementary Figure 1). Figure 1A shows the silver stain gel for each complex isolation and the enrichment of numerous bands for each as compared to the HT alone control. Mass spectrometry of each revealed notably several transcriptional and epigenetic interacting proteins identified in biological replicates and enriched over the HT alone control, including the known TET1–SIN3A interaction and the absence of this with TET2 (Williams et al, 2011; Figure 1B). All TET proteins showed interaction with O-GlcNAc transferase, OGT, (Figure 1B), though TET2 and TET3 showed demonstrably higher enrichment. Given this, we focused all following experiments with the TET2 and TET3 family members. Two approaches were used to confirm the interaction between TET2 or TET3 and OGT: (i) western blotting with anti-OGT antibody, applied to samples of eluate from the above-mentioned HT-pulldown experiments (Figure 1C), and (ii) co-immunoprecipitations (Co-IPs) showing capture of both TET2 and TET3 from extracts of untransfected cells upon immunoprecipitation with an anti-OGT antibody, confirming the interaction of endogenous TET2 and TET3 with OGT (Figure 1D). Input loading controls of OGT are shown for each (Figures 1C and D). A variant of TET2 lacking the catalytic domain (TET2ΔCD) did not show interaction with OGT (Figures 1A and C; Supplementary Figure 2), indicating that the catalytic domain is important for the OGT interaction and demonstrating the specificity of the HT pulldown and mass spectrometry analysis. Supporting this, FLAG Co-IP experiments performed with FLAG-TET2 and -TET3 CD alone showed interaction with transfected or endogenous OGT (Supplementary Figure 3). Furthermore, to evaluate whether the interaction is direct, an in vitro protein isolation was performed using E. coli expressed and purified full-length OGT incubated with E. coli expressed HT-TET2CD or HT alone control covalently bound to resin. As shown in Supplementary Figure 3, OGT was specifically enriched on resin containing the TET2CD as compared to the control. Together, these data demonstrate that TET2 and TET3 interact directly with the OGT glycosyltransferase. Figure 1.TET2 and TET3 associate with the O-GlcNAc transferase OGT and promote GlcNAcylation. (A) Silver stain gel of HaloTag-TET protein complex isolations and HaloTag alone control (Ctrl). Protein pulldowns were performed from HEK293T cells overexpressing the indicated HT constructs (see Materials and methods and Supplementary Figure 1 for details). As not all of the indicated complex isolations were performed at the same time, two separate silver stain gels were run, as shown in this panel. (B) Table of transcriptional or chromatin protein interactors found in the various HaloTag-TET isolations. Spectral counts for each interacting protein are shown for biological replicates. TET1, but not TET2, as previously reported (Williams et al, 2011; Wu et al, 2011), shows interaction with SIN3A. OGT interacts with all TET proteins, though it is most highly abundant with TET2 and TET3. (C) Detection of OGT by western blotting from HT-TET2 and HT-TET3 pulldowns from (A). The indicated pulldowns were probed with an anti-OGT antibody to detect the presence of OGT. OGT and beta-Actin shown as input loading controls. (D) TET2 and TET3 co-immunoprecipitate (CoIP) with endogenous OGT from untransfected HEK293T cells. Cell extracts were immunoprecipitated with anti-OGT or rabbit IgG and probed with antibodies against the indicated proteins. An IP control of OGT alone is shown to demonstrate specific capture and enrichment of OGT. Inputs loading controls are shown for all. Note that in this experiment very weak expression of TET2 relative to TET3 is observed. (E) The global level of hmC does not change after cell treatment with Alloxan or PUGNAc. Dot blot quantification of global hmC after the indicated treatments. The hmC content is normalized with respect to the input DNA and to mock-treated cells, where the ratio is set at 1.00. Error bars indicate s.d. of three independent experiments. As controls, western blots using anti-O-GlcNAc antibody show the expected decrease in GlcNAcylation with Alloxan and increase with PUGNAc. HDAC1 input loading controls are also shown. Vertical line indicates juxtaposition of lanes non-adjacent within the same blot, exposed for the same time. (F) Global decrease in GlcNAcylation is observed in TET2/3 knockdowns. Left: TET2 kd or TET3 kd show decreased GlcNAc activity. Nuclear extracts were prepared from HEK293T cells expressing RNAi Ctrl, RNAi TET2, or RNAi TET3, and UDP-[3H]GlcNAc incorporation was measured. The amount incorporated into the control cells was set at 1. Error bars indicate s.d. of three independent experiments (*P<0.05). Right: Nuclear extracts were prepared from HEK293T cells expressing RNAi Ctrl or RNAi TET2/3 and global GlcNAcylation was visualized with an antibody against O-GlcNAc. HDAC1 input loading control is also shown. Download figure Download PowerPoint TET2 and TET3 promote OGT-mediated GlcNAcylation OGT places O-GlcNAc modifications on numerous proteins, including transcription factors, epigenetic regulators, and also histones (Hart et al, 2007). GlcNAcylation can activate or inhibit protein activity and serve as a mark to recruit other proteins (Slawson and Hart, 2011). As several proteins that interact with OGT are also regulated by GlcNAcylation (Hart et al, 2007), we analysed TET2 and TET3 by mass spectrometry for the presence of O-GlcNAc modifications. Despite high levels of spectral counts (∼400) for both proteins, GlcNAcylation could not be detected for either protein (data not shown). Based upon these results, we predict if TET proteins are GlcNAcylated, they would be at low levels. As TET and OGT are both enzymes, we next sought to determine if their respective activities are altered by each other. To evaluate if the enzymatic activity of OGT might influence hydroxymethylation by the TET enzymes, we measured the overall abundance of the hmC mark in dot blot assay using a specific hmC antibody (Supplementary Figure 4) in the absence or presence of either Alloxan, an OGT inhibitor, or PUGNAc, which prevents removal of the O-GlcNAc modification by inhibiting the enzyme O-linked N-acetylglucosaminidase (OGA) (Capotosti et al, 2011; Fujiki et al, 2009). As shown in Figure 1E, no changes in overall hmC level were observed with these respective treatments (upper panel), while a western blot of lysates revealed the expected impact on global levels of O-GlcNAc for each (lower panel). Similarly, overexpression of HT-OGT did not increase levels of hmC, while overexpression of a TET2CD alone control did (Supplementary Figure 4). Hence, cytosine hydroxylation does not appear to require the GlcNAcylating activity of OGT. We then investigated if GlcNAcylation might depend on TET2 and/or TET3. To answer this question, we measured overall OGT activity in lysates of cells where RNAi was used to knock down TET2 or TET3 (cf. Supplementary Figure 5 for RNAi efficiency and controls). As shown in Figure 1F (left panel), we observed lower GlcNAcylation activity in TET2 or TET3 RNAi than in the control cells. Following with this, in a TET2 and TET3 double RNAi kd (referred to as TET2/3 kd) a discernable decrease in O-GlcNAc modified proteins is seen as revealed by western blot analysis using an anti-O-GlcNAc antibody (Figure 1F, right panel; Supplementary Figure 5). To demonstrate that decreased OGT activity was not due to change in levels of OGT, analysis of lysates from mock RNAi and TET2/3 kd cells revealed that protein levels of OGT were unchanged after depletion of TET2 and TET3 (Supplementary Figures 5 and 6). These combined data suggest that TET2/3 positively impacts the activity of OGT. TET2, TET3, and OGT show genome-wide co-localization, notably at CpG islands and at transcription start sites We next undertook to map genome-wide binding of TET2, TET3, and OGT, looking for their possible co-occurrence at genomic targets. We performed crosslinking and chromatin isolation from HEK293T cells, expressing HT fusion proteins (Los et al, 2008; Hartzell et al, 2009) coupled with high-throughput sequencing (Supplementary Figure 7). Our results show that TET2, TET3, and OGT all localize primarily to CpG islands (CGI) and promoter regions (Figure 2A; Supplementary Figure 8), similar to previously observed localization for Tet1 in mouse ES cells (Ficz et al, 2011; Williams et al, 2011; Wu et al, 2011). Co-occurrence analysis of OGT binding sites revealed statistically significant overlaps with TET2 (42%) (Figure 2A) and TET3 (55%) (Supplementary Figure 8; Supplementary Table 2). The TET2–OGT and TET3–OGT targets are primarily contained within promoter regions, tightly clustered around transcription start sites (TSSs), with intermediate to high CpG content (ICP and HCP) (Figure 2A; Supplementary Figures 8 and 9; Supplementary Table 2). Figure 2.TET2/3–OGT show genomic co-localization around TSSs and impact on H3K4me3 and transcriptional activation. (A) Left: Venn diagrams indicating significant overlap of TET2 and OGT bound regions (left part; P-value<10−10) identified after HaloCHIP-Seq in HEK293T cells expressing HT-TET2, or HT-OGT. Right: TET2–OGT targets are primarily found at TSSs and CpG-rich sequences. Similar profiles were also observed for TET3–OGT (Supplementary Figure 8). (B) An analysed subset of TET2–TET3–OGT targets show a lack of DNA methylation and hydroxymethylation, yet display GlcNAcylation. qPCR analysis of TET2–TET3–OGT binding and non-binding regions after MeDIP (top), hMeDIP (middle), or ChIP with an anti-O-GlcNAc antibody (bottom). '% Input' represents real-time qPCR values normalized with respect to the input chromatin. Known methylated and hydroxymethylated regions are shown as positive controls in MeDIP and hMeDIP panels. Download figure Download PowerPoint TET2, TET3, and OGT genomic targets are enriched for GlcNAcylation, but not for 5hmC or 5mC We then examined the DNA methylation, DNA hydroxymethylation, and protein GlcNAcylation status of selected TET2/3–OGT target sequences. As shown in Figure 2B (upper and middle panels), methylated DNA and hydroxymethylated DNA immunoprecipitations (MeDIP and hMeDIP) followed by quantitative PCR (qPCR) analysis revealed essentially no enrichment of 5mC or 5hmC, respectively, at these targets in either immunoprecipitate. Significant enrichment of O-GlcNAc was found for TET2/3–OGT targets using chromatin immunoprecipitation (ChIP)-qPCR against O-GlcNAc (Figure 2B, lower panel), indicating OGT activity at these chromatin sites. Together, these data show co-occurrence of TET2, TET3, and OGT, which in a subset analysed, lack DNA methylation and hydroxymethylation, but display protein GlcNAcylation. TET2, TET3, and OGT co-localize with and influence H3K4 trimethylation at active promoters in human cells The clustering of TET2/3–OGT primarily at TSSs and HCP promoters (cf. Figure 2A) led us next to examine the genomic overlap at promoters with H3K4 trimethylation (H3K4me3), an expected mark at these sites which is also correlated with transcriptional activity. As depicted in Figures 2C and D, ChIP-Seq with an antibody against H3K4me3 confirmed an expected high overlap (98%) of TET2/3–OGT targets with the H3K4me3 mark. We then wondered whether TET proteins might be involved in regulating H3K4me3, and therefore repeated ChIP-Seq experiment in cells containing a TET2 RNAi kd. We observed a significant reduction of H3K4me3 at over 78% of the TET2/3–OGT genomic targets (Figure 2E). A similar impact on global reduction of H3K4me3 is observed in western blot analysis of TET2/3 knockdown cellular lysates (Figure 2F). As reduction in H3K4me3 could occur through a variety of mechanisms, we then sought to determine if there was a connection to OGT activity. Supporting this hypothesis and similar to the above data with TET2/3 kd (Figure 2F), cells treated with the OGT inhibitor, Alloxan, show also a decrease in global H3K4me3 as compared to controls (Figure 2G). Thus, TET2/3–OGT targets are enriched for H3K4me3, which is regulated by both the TET proteins and OGT activity. Figure 3.(C) TET2/3–OGT targets in HEK293T cells are enriched for H3K4me3 as depicted in a Venn diagram; P-value<10−10. (D) Examples of HaloCHIP-Seq OGT, TET2, TET3, and ChIP-Seq H3K4me3 profiles (UCSC tracks). (E) Decreased levels of H3K4me3 in TET2 kd cells. Upper-left: decrease in the normalized number of H3K4me3 reads in TET2/3–OGT-binding regions in TET2 kd cells versus control RNAi-treated cells. Upper-right: pie chart showing the percentage of TET2–TET3–OGT binding regions with a statistically significant reduction of the normalized number of H3K4me3 reads for TET2 kd versus control RNAi-treated cells. Lower-part: examples of H3K4me3 ChIP-Seq profiles (UCSC tracks) in TET2–TET3–OGT-binding regions for the RNAi control versus TET2 kd sample. (F) Western blot showing global decrease in H3K4me3 in a TET2/3 double kd cells. Lysates from mock HEK293T RNAi kd or TET2/3 kd cells were probed for H3K4me3 using an anti-H3K4 antibody in western blot. Tubulin is shown as a loading control. (G) OGT activity is important for H3K4me3. Cell extracts were prepared from HEK293T cells treated with or without the OGT inhibitor Alloxan, and then western blots for H3K4me3 were performed. HDAC1 and H3 are shown as loading controls and a western blot against O-GlcNAc was used to monitor specific GlcNAcylation inhibition by Alloxan. Vertical lines indicate juxtaposition of lanes non-adjacent within the same blot, exposed for the same time. (H) Decreases in transcription are observed in both TET2/3 knockdowns and an OGT knockdown. The indicated target genes (which showed decrease in H3K4me3 after TET2 kd; cf. E) and negative controls (unbound TET2/3–OGT–H3K4me3 targets), were analysed by RT–qPCR in HEK293T cells subjected to the various listed RNAi treatments. Independent experiments were performed in duplicates. Download figure Download PowerPoint To correlate these data to gene activity, we found by ChIP-Seq a marked co-occupancy of TET2/3–OGT–H3K4me3 targets with RNA polymerase II (RNA Pol II) and by RNA Sequencing (RNA-Seq) analyses a significant and positive correlation with high expression levels (Supplementary Figure 10). To determine if there are effects on transcriptional levels after loss of TET and/or OGT, we then analysed by RT–qPCR a subset of TET2/3–OGT targets specifically decreased in H3K4me3 after TET kd, as identified in Figure 2E. As shown in Figure 2H, moderate, but reproducible and specific decreases in expression of targets after TET2/3 kd match patterns to those observed in OGT RNAi kd. Together, these data suggest that TET2/3–OGT–H3K4me3 targets are highly transcribed regions and for the subset studied, show concomitant transcriptional activation by both TET proteins and OGT. TET2 and TET3 associate with HCF1, an OGT-modified target and component of the H3K4 methyltransferase complex SET1/COMPASS We next wished to extend our observed TET2/3–OGT interaction and identify potential specific downstream protein targets that may connect to H3K4me3 regulation. With this in mind, we noticed in our initial proteomic analysis for TET2 and TET3 that besides OGT (cf. Figure 1B), Host Cell Factor 1 (HCF1) was also identified and similarly to OGT, was decreased in the TET2ΔCD isolation (Figure 3A). HCF1 was of interest as not only is it a known GlcNAcylation target of OGT (Capotosti et al, 2011), but also a component of the histone H3K4 methyltransferase complex, SET1/COMPASS (Wysocka et al, 2003; Lee et al, 2010). ChIP-Seq experiments for endogenous HCF1 showed overlap of HCF1 target genes with those of Halo-TET2, TET3, OGT, and H3K4me3 (Supplementary Figure 11A). We then desired to further the mechanistic understanding of the TET2- or TET3-OGT–HCF1 interactions with relationship to H3K4me3, and therefore examined the interactions of OGT using a similar HT proteomics approach including mass spectrometry analysis. Interacting partners of HT-OGT included the previously identified HCF1 protein (Capotosti et al, 2011), the TET2 and TET3 proteins (confirming the TET–OGT interaction), and interestingly, all components of SET1/COMPASS (Figure 3B). To determine if the interactions were dependent on OGT activity, we repeated the above experiments in the presence of the OGT inhibitor Alloxan. Such treatment resulted not only in the expected decrease in OGT–HCF1 interaction (Capotosti et al, 2011), but also in significant loss of capture of the SET1/COMPASS components, including the H3K4 methyltransferase SETD1A (Figure 3C). Normalized spectral abundance factors (NSAFs) showed the same trend (Supplementary Figure 11B), therefore validating the direct comparison of respective loss of spectral counts for each protein within the samples. Mass spectrometry analysis of HCF1 peptides from HT-OGT protein isolations with or without Alloxan treatment showed high levels of GlcNAcylation in untreated cells and reduction after Alloxan treatment (Supplementary Figure 12A), matching previously published results (Capotosti et al, 2011). Figure 4.TET2/3 promotes GlcNAcylation of HCF1, and both TET and OGT activity favour the integrity of SET1/COMPASS and SETD1A binding to chromatin. (A) Mass spectrometry reveals HCF1, a known target of OGT (Wysocka et al, 2003) and component of SET1/COMPASS (Lee et al, 2010), as an interacting partner of HT-TET2 and HT-TET3. Biological duplicates and respective spectral counts (SpC) for HCF1 are shown. (B) Protein pulldowns of HT-OGT coupled with mass spectrometry identify HCF1, TET2, TET3, and all components of SET1/COMPASS as partners of OGT. Biological duplicates and SpC for each protein identified are shown for HT-OGT and Ctrl isolations. (C) The interaction of HCF1 and SET1/COMPASS components with HT-OGT depends on O-GlcNAc activity. Plot showing average SpCs for HCF1 and SET1/COMPASS components isolated from HT-OGT pulldowns of untreated (grey bars) and Alloxan-treated (green bars) HEK293T cells. Error bars represent s.d. of biological duplicates. Representative NSAF plots are shown in Supplementary Figure 11. (D) The interaction of HT-SETD1A with SET1/COMPASS components and OGT is reduced by a TET2/3 double kd. Plot showing average SpCs for SET1/COMPASS components and OGT isolated from HT-SETD1A pulldowns of control RNAi-treated (grey bars) and TET2/3 kd (blue bars) HEK293T cells. Error bars represent s.d. of biological duplicates. Representative NSAF plots are shown in Supplementary Figure 11. (E) A significant reduction in HCF1 GlcNAcylation is observed after TET2/3 double kd. Uppe

Article31 January 2012Open Access DNA methylation profiling identifies epigenetic dysregulation in pancreatic islets from type 2 diabetic patients Michael Volkmar Michael Volkmar Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Sarah Dedeurwaerder Sarah Dedeurwaerder Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Daniel A Cunha Daniel A Cunha Laboratory of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Matladi N Ndlovu Matladi N Ndlovu Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Matthieu Defrance Matthieu Defrance Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Rachel Deplus Rachel Deplus Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Emilie Calonne Emilie Calonne Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Ute Volkmar Ute Volkmar Department of Molecular Evolution, Institute for Cellular and Molecular Biology (IZMB), University of Bonn, Bonn, Germany Search for more papers by this author Mariana Igoillo-Esteve Mariana Igoillo-Esteve Laboratory of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Najib Naamane Najib Naamane Laboratory of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Silvia Del Guerra Silvia Del Guerra Metabolic Unit, Department of Endocrinology and Metabolism, University of Pisa, Pisa, Italy Search for more papers by this author Matilde Masini Matilde Masini Metabolic Unit, Department of Endocrinology and Metabolism, University of Pisa, Pisa, Italy Search for more papers by this author Marco Bugliani Marco Bugliani Metabolic Unit, Department of Endocrinology and Metabolism, University of Pisa, Pisa, Italy Search for more papers by this author Piero Marchetti Piero Marchetti Metabolic Unit, Department of Endocrinology and Metabolism, University of Pisa, Pisa, Italy Search for more papers by this author Miriam Cnop Miriam Cnop Laboratory of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Division of Endocrinology, Erasmus Hospital, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Decio L Eizirik Decio L Eizirik Laboratory of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author François Fuks Corresponding Author François Fuks Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Michael Volkmar Michael Volkmar Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Sarah Dedeurwaerder Sarah Dedeurwaerder Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Daniel A Cunha Daniel A Cunha Laboratory of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Matladi N Ndlovu Matladi N Ndlovu Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Matthieu Defrance Matthieu Defrance Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Rachel Deplus Rachel Deplus Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Emilie Calonne Emilie Calonne Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Ute Volkmar Ute Volkmar Department of Molecular Evolution, Institute for Cellular and Molecular Biology (IZMB), University of Bonn, Bonn, Germany Search for more papers by this author Mariana Igoillo-Esteve Mariana Igoillo-Esteve Laboratory of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Najib Naamane Najib Naamane Laboratory of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Silvia Del Guerra Silvia Del Guerra Metabolic Unit, Department of Endocrinology and Metabolism, University of Pisa, Pisa, Italy Search for more papers by this author Matilde Masini Matilde Masini Metabolic Unit, Department of Endocrinology and Metabolism, University of Pisa, Pisa, Italy Search for more papers by this author Marco Bugliani Marco Bugliani Metabolic Unit, Department of Endocrinology and Metabolism, University of Pisa, Pisa, Italy Search for more papers by this author Piero Marchetti Piero Marchetti Metabolic Unit, Department of Endocrinology and Metabolism, University of Pisa, Pisa, Italy Search for more papers by this author Miriam Cnop Miriam Cnop Laboratory of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Division of Endocrinology, Erasmus Hospital, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Decio L Eizirik Decio L Eizirik Laboratory of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author François Fuks Corresponding Author François Fuks Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Search for more papers by this author Author Information Michael Volkmar1, Sarah Dedeurwaerder1, Daniel A Cunha2, Matladi N Ndlovu1, Matthieu Defrance1, Rachel Deplus1, Emilie Calonne1, Ute Volkmar3, Mariana Igoillo-Esteve2, Najib Naamane2, Silvia Del Guerra4, Matilde Masini4, Marco Bugliani4, Piero Marchetti4, Miriam Cnop2,5, Decio L Eizirik2 and François Fuks 1 1Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium 2Laboratory of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium 3Department of Molecular Evolution, Institute for Cellular and Molecular Biology (IZMB), University of Bonn, Bonn, Germany 4Metabolic Unit, Department of Endocrinology and Metabolism, University of Pisa, Pisa, Italy 5Division of Endocrinology, Erasmus Hospital, Brussels, Belgium *Corresponding author. Laboratory of Cancer Epigenetics, Faculty of Medicine, Université Libre de Bruxelles, 808 Route de Lennik, Brussels 1070, Belgium. Tel.: +32 2 555 62 45; Fax: +32 2 555 62 57; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2012)31:1405-1426https://doi.org/10.1038/emboj.2011.503 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info In addition to genetic predisposition, environmental and lifestyle factors contribute to the pathogenesis of type 2 diabetes (T2D). Epigenetic changes may provide the link for translating environmental exposures into pathological mechanisms. In this study, we performed the first comprehensive DNA methylation profiling in pancreatic islets from T2D and non-diabetic donors. We uncovered 276 CpG loci affiliated to promoters of 254 genes displaying significant differential DNA methylation in diabetic islets. These methylation changes were not present in blood cells from T2D individuals nor were they experimentally induced in non-diabetic islets by exposure to high glucose. For a subgroup of the differentially methylated genes, concordant transcriptional changes were present. Functional annotation of the aberrantly methylated genes and RNAi experiments highlighted pathways implicated in β-cell survival and function; some are implicated in cellular dysfunction while others facilitate adaptation to stressors. Together, our findings offer new insights into the intricate mechanisms of T2D pathogenesis, underscore the important involvement of epigenetic dysregulation in diabetic islets and may advance our understanding of T2D aetiology. Introduction Type 2 diabetes (T2D) has developed into a major public health concern. While previously considered as a problem primarily for western populations, the disease is rapidly gaining global importance, as today around 285 million people are affected worldwide (IDF, 2009). Lifestyle and behavioural factors play an important role in determining T2D risk. For example, experimentally induced intrauterine growth retardation as well as nutrient restriction during pregnancy in rats have been shown to result in development of T2D in offspring (Inoue et al, 2009) while chronic high-fat diet in fathers programs β-cell dysfunction in female rat offspring (Ng et al, 2010). In humans, a reduced birth weight together with an accelerated growth in infancy has been associated with impaired glucose tolerance (IGT) in adulthood (Bhargava et al, 2004). The pancreatic islets of Langerhans are of central importance in the development of T2D. Under normal conditions, increasing blood glucose levels after a meal trigger insulin secretion from the pancreatic islet β-cells to regulate glucose homeostasis. β-Cell failure marks the irreversible deterioration of glucose tolerance (Cnop et al, 2007b; Tabak et al, 2009) and results in T2D (UKPDSG, 1995). The unbiased genome-wide search for T2D risk genes (Saxena et al, 2007; Scott et al, 2007; Sladek et al, 2007; Zeggini et al, 2007, 2008) has placed the insulin-producing β-cells at centre stage. These approaches have also inadvertently highlighted the complexity of the biological mechanisms critical to T2D development. Most T2D risk genes identified in these genome-wide association studies (GWAS) affect β-cell mass and/or function (Florez, 2008). While the majority of studies in the field have characterised diabetes aetiology on the basis of genetics, new findings suggest the potential involvement of epigenetic mechanisms in T2D as a crucial interface between the effects of genetic predisposition and environmental influences (Villeneuve and Natarajan, 2010). Epigenetic changes are heritable yet reversible modifications that occur without alterations in the primary DNA sequence. DNA methylation and histone modifications are the main molecular events that initiate and sustain epigenetic modifications. These modifications may therefore provide a link between the environment, that is, nutrition and lifestyle, and T2D but only few studies so far have documented aberrant DNA methylation events in T2D (Ling et al, 2008; Park et al, 2008). DNA methylation occurs as 5-methyl cytosine mostly in the context of CpG dinucleotides, so-called CpG sites. It is the best-studied epigenetic modification and governs transcriptional regulation and silencing (for review, see Suzuki and Bird, 2008). Unlike the relatively study genome, the methylome changes in a dynamic way during development, tissue differentiation and aging. Pathologically altered DNA methylation is well described in various cancers (reviewed in Jones and Baylin, 2007) and its role is starting to be revealed in several other diseases such as multiple sclerosis (Casaccia-Bonnefil et al, 2008), Alzheimer's disease (Mastroeni et al, 2009) and systemic lupus erythematosus (Javierre et al, 2010). About 75% of human gene promoters are associated with CpG islands (CGIs) (Jones and Baylin, 2007; Suzuki and Bird, 2008), which are clusters of 500 bp to 2 kb length with a comparatively high frequency of CpG dinucleotides. They usually harbour low levels of DNA methylation but can become hypermethylated; this CGI hypermethylation was demonstrated to abrogate transcription of tumour suppressor genes during tumourigenesis (Jones and Baylin, 2007). Lately, DNA methylation changes in CpG sites adjoining yet outside of CGIs, so-called CGI shores (Irizarry et al, 2009), are gaining increased attention. Intriguingly, CpG sites in these shore sequences, in addition to those within CGIs, are proposed to display differential DNA methylation between cancer and normal cells as well as between cells of different tissues (Irizarry et al, 2009). The goal of the present work was to clarify the hitherto poorly understood connection between DNA methylation and T2D pathogenesis and to determine whether identified epigenetic changes translate into functional effects that impinge on pancreatic β-cell function. For this, we have explored DNA methylation landscapes in islets isolated from T2D patients and non-diabetic individuals. Results Identification of the T2D-related differential DNA methylation profile We performed DNA methylation profiling to analyse the methylomes of freshly isolated islets from 16 human cadaveric donors of similar age, BMI and ethnicity (5 diabetic and 11 non-diabetic Caucasian donors; Table I). Using electron microscopy (EM), we examined the purity of the islet preparations (see Supplementary data). In diabetic islets, decreases in the percentage of β-cells have been reported (Sakuraba et al, 2002; Rahier et al, 2008). As shifts in the composition of islet cell types (especially β-cells that constitute about two thirds of the islet cell mass) with different epigenomes might overlay T2D-related changes in the cells’ DNA methylation patterns, we used EM to estimate the percentage of β-cells. The amount of β-cells in three randomly chosen control islet preparations was 66.3±0.9%. Diabetic islets (n=3, randomly chosen) contained only marginally less β-cells, accounting for 59.7±1.7% of total islet cell number (cf. Supplementary Table S1, Materials and methods, Supplementary data). Table 1. Pancreatic islet donor characteristics CTL T2D Number of samples 11 5 Age (years) 57.2±15.2 64.4±5.3 (P=0.33) BMI (kg/m2) 27.0±1.1 26.5±2.2 (P=0.8) Glucose-induced insulin secretion (ratio of secretion at 16.7 mM/3.3 mM glucose) 3.59±1.05 1.24±0.3 (P<0.001) To perform DNA methylation profiling, we used the recently developed Infinium Methylation Assay (Illumina® Infinium® HumanMethylation27 BeadChip; Supplementary Figure S1; Bibikova et al, 2009). This assay interrogates the methylation status of 27 578 CpG sites corresponding to 14 475 consensus coding sequences and well-known cancer genes (Bibikova et al, 2009). Although the Infinium methylation assay is not a genome-wide DNA methylation technology, it is a useful screening tool that is sensitive, specific and highly reproducible (Bibikova et al, 2009) allowing for analysis of a defined set of CpG sites in a large number of samples. The analysed CpGs are primarily located in proximal promoter regions (and preferentially inside CGIs) and the array encompasses probes with an average coverage of 1.9 CpG sites per promoter. As an initial step, we evaluated whether DNA methylation changes in T2D were sufficient to distinguish the diabetic from the control samples when comparing complete methylation profiles. For this, an unsupervised hierarchical clustering was performed which placed the diabetic islet samples as one self-contained group distinct from the control samples in the resulting dendrogram (Supplementary Figure S2). This outcome highlights two facts: first, diabetic DNA methylation profiles are more similar to each other than to the methylation profile of any control sample, indicating the possibility of a T2D-specific DNA methylation profile; second, the existence of a single branch containing the five diabetic samples shows that the DNA methylation changes are sufficiently pronounced (even in the unfiltered data sets) to distinguish diabetic from control samples. To further substantiate the correlation of variations of DNA methylation with T2D, we performed a principal component analysis on the data set (Materials and methods; Supplementary Figure S3) and compared the resulting principal components with the T2D state in a point-biserial correlation (Lowry, 1998–2011). We found that PC #1 and PC #3, together accounting for 37% of the variance in the data set, correlate well with T2D state (Supplementary Figure S3). This is indicative of distinct, T2D-specific changes in the epigenome of pancreatic islets. Following this initial data analysis, we identified T2D-related methylation changes by filtering the data sets for CpG sites showing significant differences in DNA methylation levels between control and T2D groups (cf. Materials and methods and Supplementary Table S2). The results of the filtering are shown as a heatmap (Figure 1A). The depicted methylation profiles discriminate between control samples (left side, indicated by yellow bar above heatmap) and T2D samples (right side, indicated by blue bar). It is already apparent from the above data that there are marked DNA methylation changes in T2D islets. The number of differentially methylated CpG loci in T2D islets is in the same range as reported for other non-malignant conditions analysed with the same technology platform (19 in T1D-related nephropathy; Bell et al, 2010); 84 and 360, respectively, in analyses of ageing in cells and tissue specimens (Bork et al, 2009; Rakyan et al, 2010). Figure 1.Hierarchical profile-based clustering and evaluation of T2D islet DNA methylation. (A) A heatmap of the differentially methylated CpG loci shows distinct patterns separating data sets obtained from CTL (yellow line above heatmap) and T2D samples (blue line). (B) Supervised clustering based on the differentially methylated CpG loci separates T2D from control samples. As an indication of statistical significance, bootstrap values (>0.7) are shown next to the branches. Note that the order of samples in the heatmap in Figure 1A follows the one established by supervised clustering. (C) Pie chart depicting the 276 CpG sites showing differential methylation between T2D and control samples (see also Supplementary Table S2). Note the high proportion of hypomethylation events as compared with hypermethylation events. (D) LINE-1 repetitive element DNA methylation for CTL and T2D samples by BPS (n=11 for CTL; n=5 for T2D). Download figure Download PowerPoint We then set out to evaluate the descriptive power of the CpG sites in the filtered data set to differentiate diabetic from non-diabetic specimens in sample-wise comparisons. We therefore extracted the methylation values for each sample and performed a supervised clustering (Figure 1B, cf. Materials and methods). As expected, the resulting dendrogram shows that samples group together in two clusters containing exclusively control (CTL, yellow bar) or diabetic (T2D, blue bar) samples, indicating that class identity (CTL, T2D) is the most important separation criterion (Figure 1B, left-most branch). To assess clustering confidence in an unbiased way and to overcome inherently subjective visual interpretation of the results depicted in the heatmap (Figure 1A), a bootstrapping analysis was carried out after dendrogram computation (cf. Materials and methods). The obtained bootstrap of 0.85 indicates significant statistical support for the bipartite distribution between diabetic and non-diabetic samples based on the analysis of the CpGs contained in the filtered data set. The occasional high bootstrap values adjoined to sample pairs illustrate similarities in the DNA methylation profiles of these samples. These data demonstrate that human pancreatic islets undergo DNA methylation alterations in T2D that are discernible by means of DNA methylation profiles. T2D-related aberrations encompass mostly promoter-specific DNA hypomethylation The above experiments enabled us to collect the first comprehensive DNA methylation data set for T2D human islets. We identified 276 CpG sites, affiliated to 254 gene promoters, showing differential methylation between normal and diseased samples (Figure 1C; Supplementary Table S2). Strikingly, 266 of these 276 CpGs (96%) showed decreased methylation levels, while only 10 were hypermethylated (Figure 1C). This unexpected finding contrasts with the well-known DNA methylation changes observed in cancers, where gene-specific hypomethylation and hypermethylation are more or less evenly distributed (Jones and Baylin, 2007). With respect to global DNA methylation, cancers generally display hypomethylation (Jones and Baylin, 2007; Tost, 2010), primarily in repetitive DNA. To test whether the observed T2D-related changes are gene specific or whether they reflect global hypomethylation in the genome of islet cells, we measured DNA methylation levels of the repetitive LINE-1 element in control and diabetic samples with bisulphite pyrosequencing (BPS). Analysing DNA methylation of LINE-1, which makes up ∼20% of human genome, provides an accurate estimate of global DNA methylation changes (Yang et al, 2004). Figure 1D shows that repetitive elements are not differentially methylated in T2D, as substantiated by the strong overlap between CTL and T2D samples, indicating the absence of global hypomethylation in T2D islets. As an additional quality control, we examined the set of 276 differentially methylated CpG sites for overlap with known single-nucleotide polymorphism (SNP) positions to be excluded from further data analysis. We found no overlap with the reported 180 potentially problematic CpG sites contained in the Humanmethylation27 array (Bell et al, 2011) and therefore continued our analyses with the full set of 276 CpGs. BS validation of T2D-related differential DNA methylation To corroborate the observed Infinium measurements (cf. Figure 1 and Supplementary Table S2), we applied BPS and in some cases conventional BS to randomly selected, differentially methylated CpG sites. In all 19 cases tested, differential DNA methylation at the respective CpG sites was confirmed by BPS (Figure 2; Supplementary Figure S4). Where implemented, BS also confirmed the DNA methylation profiling data (Figure 2A; Supplementary Figure S4A). Figure 2A depicts an exemplary analysed gene, ALDH3B1, for which the Infinium data were confirmed by BS and BPS. Additional validated genes are shown in Figure 2B (CASP10) and Figure 2C (PPP2R4 alias PP2A). We discovered two differentially methylated CpG sites inside a CGI in the IGF2/IGF2AS locus. The differential methylation of one of the CpGs in this region was tested and confirmed by BPS (Figure 2D). Further examples are shown in Supplementary Figure S4. A direct comparison of methylation percentages obtained by the Infinium Methylation assay and BPS (Figure 2E) yielded a highly positive correlation (Pearson's correlation R=0.927) confirming the validity of the data. BPS analysis of three negative controls constituting high (>90%), intermediate (∼40%) and low (<10%) levels of DNA methylation showed expectedly no differential DNA methylation between sample groups (Supplementary Figure S4M–O). Of note, CpG sites neighbouring the Infinium-assayed site are often encompassed in the BPS experiments (cf. Figure 2 and Supplementary Figure S4); these adjacent CpG sites also displayed similar DNA methylation levels. Hence, our validation experiments indicate that individual CpGs from the Infinium Methylation array can be used as informative markers for the methylation status of the respective surrounding regions. Taken together, BPS and BS results confirm the methylation values obtained from the Infinium-based assay, thus validating the T2D-specific DNA methylation profiles. Figure 2.Validation of aberrantly methylated loci in T2D islets. (A) An exemplary locus, ALDH3B1, is shown. Methylation data for the indicated CpGs obtained with the Infinium assay as well as by conventional bisulphite sequencing (BS), and by bisulphite pyrosequencing (BPS), are compared. Detected DNA methylation levels at other loci (B–D) are also in good agreement between the Infinium methylation assay (bar charts above the gene scale) and BPS used for validation (bar charts below gene scale) (see Supplementary Figure S4 for further examples). CpG islands are indicated by a green line below gene scale. (E) Validation of the Infinium DNA methylation data by BPS. Methylation values obtained by Infinium assay and BPS show high correlation (Pearson's correlation coefficient R=0.927); (n=3–8 for CTL; n=3–5 for T2D). Download figure Download PowerPoint Genomic features associated with differential DNA methylation in T2D Having shown that the observed differential DNA methylation in T2D is gene-specific rather than global (cf. Figure 1D), we set out to determine whether this aberrant DNA methylation is (a) located within or outside CGIs, (b) prevalent in distinct promoter classes (that are based on CpG density) or (c) correlated with specific regulatory elements. Previous work that investigated the localisation of differential DNA methylation in cancer and different tissues has suggested that substantial DNA methylation differences occur in CGI shores (Doi et al, 2009; Irizarry et al, 2009). We used bioinformatic tools to determine the distance of differentially methylated CpGs to the nearest CGI. Utilising CGI prediction (Bock et al, 2007), we found that ∼50% of the differentially methylated CpG sites are located >2 kb from the nearest CGI (‘other CpGs’ in Figure 3A and B and Supplementary Table S3). Additionally, about one quarter of CpGs resides in CGI shores (1–2000 bp from a CGI border) while another quarter of CpG sites was located inside CGIs (Figure 3A; Supplementary Tables S2 and S3). A more detailed representation of the CpG distribution reveals the sites of differential methylation inside the CGI shores to be located preferentially close to the CGIs (bar chart in Figure 3B). This distribution of differentially methylated sites inside CGI shores is similar to regions showing differential methylation in cancer (c-DMRs; Irizarry et al, 2009), between tissues (t-DMRs; Irizarry et al, 2009) and during differentiation/cell reprogramming (r-DMRs; Doi et al, 2009). However, an overall comparison of differential methylation locations between these DMRs (Doi et al, 2009; Irizarry et al, 2009) and our data (Figure 3A and B) shows significant disparity, with a predominance of DNA methylation changes >2 kb away from CGIs (‘other CpGs’ in Figure 3A and B and Supplementary Table S3), thus distinguishing the localisation of the DNA methylation profile in T2D islets from those found in tumours, between tissues and in stem cells. Figure 3.Classification of differentially methylated CpG sites and regulatory element analysis of affected genes. (A) Classification of the CpG sites according to their location relative to CpG islands. Most of the differentially methylated CpG sites are affiliated to genes not possessing a CpG island or are >2 kb away from the nearest CpG island (termed ‘other CpGs’); only about one quarter of the affected CpGs is located inside a CGI (‘CGI’) and about one quarter is located in CGI shores (‘CGI shore’), that is, distance to the CGI is between 1 and 2000 bp. The observed distribution of differentially methylated CpGs is significantly different from that of the Infinium array (χ2 goodness-of-fit test P<2.2 × 10−16). (B) Representation as bar plot with spatial resolution of the CGI shore shows that differential methylation in CGI shores occurs predominantly close to CGI borders (0–0.5 and 0.5–1 kb). (C) Classification of the promoters affiliated to the CpG sites based on the promoter CpG content. The observed distribution of promoter classes among genes associated with differentially methylated CpGs is significantly distinct from that of the entirety of genes represented by CpG sites on the Infinium array (χ2 goodness-of-fit test P=7.1 × 10−14) (for numerical representation of classifications in A and C: cf. Supplementary Table S3). (D) Direct plotting of CpG ratio (cf. Materials and methods) shows T2D-associated differential methylation (blue bars) predominantly in low CpG density promoters. (E) Prediction of putative TF binding sites using the set of low CpG differentially methylated gene promoters (CpG ratio <0.5) with the Pscan transcription factor motif analysis software. Statistically significant overrepresented binding sites have been found for members of the GATA transcription factor family. Download figure Download PowerPoint We next analysed the occurrence of these differentially methylated CpG sites in relation to CpG density of the affiliated gene promoters. Saxonov et al (2006) discovered a bipartite distribution of gene promoters with minor overlap between both classes when categorising promoter sequences by means of their CpG content. They discovered that promoters are either relatively depleted of CpG sites (low CpG promoters, LCPs) or enriched in CpG sites (high CpG promoters, HCPs), preferentially around the transcription start site (TSS). Weber et al (2007) introduced a third class of promoters called intermediate CpG promoters (ICPs), to account for the overlap between the classes mentioned above. They also developed precise classification criteria for th

Abstract Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is characterized by high drug resistance and poor prognosis. Novel therapeutic and stratification strategies are urgently needed. Here, we present an integration of in-depth genomic and transcriptomic characterization with drug screening and clinical outcome based on a catalogue of 51 patient-derived tumor organoids (PDOs) from resected PDAC. Known PDAC molecular subtypes and their prognostic value are conserved in organoids. Integration of transcriptomic and drug response profiles suggest a metabolism-mediated modulations of drug resistance. Copy number alterations on chromosome 13q and wild-type status of TP53 emerged as potential novel genomic biomarkers for sensitivity to 5-FU and oxaliplatin treatment, respectively. Functional testing of targeted drugs in PDOs revealed its additional value for genome-driven personalized oncology. Co-deletion of TP53 / POLR2A increased vulnerability to RNA polymerase II inhibition, pointing to a promising target for personalized treatment in PDAC. Significance Patient-derived PDAC organoids hold great promise as surrogate tumor models for personalized oncology. By integrating highly granular molecular, drug sensitivity and clinical data, we demonstrate that PDOs are valid models for molecular characterization and response prediction that also enable identification of novel drug sensitivity biomarkers and resistance mechanisms in PDAC.

ABSTRACT Personalized cancer immunotherapies such as vaccines and T cell receptor (TCR)-transgenic T cells rely on the presentation of tumor-specific peptides by human leukocyte antigen (HLA) class I molecules to cytotoxic T cells. Such neoepitopes can for example arise from somatic mutations and their identification is crucial for the rational design of new therapeutic interventions. For their detection by liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), we have developed a parameter optimization workflow to tune targeted assays for maximum detection sensitivity on a per peptide basis, termed optiPRM. Optimization of collision energy using optiPRM allows for improved detection of low abundant peptides that are very hard to detect using standard parameters. Applying this to immunopeptidomics, we detected a neoepitope in a patient-derived xenograft (PDX) from as little as 2.5×10 6 cells input. Application of the workflow on small patient tumor samples allowed for the detection of five mutation-derived neoepitopes in three patients. One neoepitope was confirmed to be recognized by patient T cells. In conclusion, we here present optiPRM, a targeted MS workflow reaching ultra-high sensitivity by per peptide parameter optimization, which allowed for the identification of actionable neoepitopes from sample sizes usually available in the clinic.

The in-depth analysis of costimulatory signaling enhancing the activity of cytotoxic T cells (CTLs) represents a major approach towards immunotherapy development. Here we report that CD2 costimulation plays a critical role in killing by freshly isolated human CTLs, which represent a challenging but valuable study model to gain insight into CTL biology. We show that CD2 triggering critically aids signaling by the T cell receptor in the formation of functional immune synapses by promoting the polarization of lytic granules towards the microtubule-organizing center (MTOC). To gain insight into the underlying elusive mechanism, we explored the CD2 signaling network by phosphoproteomics, which revealed 616 CD2-regulated phosphorylation events in 373 proteins implicated in the regulation of vesicular trafficking, cytoskeleton organization, autophagy and metabolism. Strikingly, signaling by the master metabolic regulator AMP-activated protein kinase (AMPK) represents a functionally critical node of the CD2 network which regulates granule polarization towards the MTOC in CTLs. Granule trafficking is driven by active AMPK enriched on adjacent lysosomes, illustrating a novel signaling cross-talk between vesicular compartments in CTLs. Our results thus establish CD2 signaling as key for regulating cytotoxic killing and granule polarization in freshly isolated CTLs and strengthens the rationale to choose CD2 and AMPK as therapeutic targets to boost CTL activity.

Abstract In human tumor models we tried to identify and clone the TCR of tumor-reactive T cells enriched in mixed lymphocyte tumor-cell cultures (MLTC). In a particular MLTC, we identified a predominant TCR beta chain using the Beta Mark Vbeta Kit, but a corresponding alpha chain could not be amplified via RT-PCR using TRAV -specific forward primers. Therefore, we applied 5’RACE to obtain the TCR alpha chain sequences. The 5’RACE product revealed an alpha chain that encompassed 89bp of the TRDV1 5’UTR, followed by the TRDV1 coding sequence joined in frame to TRAJ24 . The ORF reaching from the TRDV1 start codon to the TRAC segment was intact, suggesting a functional TCR. To analyze this MLTC population in greater depth we conducted 10X VDJ sequencing. CellRanger identified the beta chain known from the Beta Mark analysis, but no corresponding alpha chain in the filtered results. The corresponding TRDV-containing TCR alpha chain could, however, be detected in the “all_contig_annotations” files. In a separate project, we performed TCR sequencing of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) in a murine tumor model. Also here, a predominant clonotype contained a TCR alpha chain joining Trdv2-2 in frame to Traj49 . Transfection of both TCR cDNAs resulted in cell surface localization of TCR and CD3 as validated by FACS. Tumor recognition of the human, TRDV1-containing TCR could be demonstrated by IFNgamma ELISpot whereas the murine TCR did not recognize a tumor-derived cell line. TRDV-containing alpha chains have been reported in the literature for two HLA I-restricted TCRs against HIV peptides (Ueno et al, Eur J Immunol, 2003). To determine whether such TDRV-containing TCRs are unique events or whether Vdelta segments are commonly incorporated into TCR alpha chains, we queried the NCBI Sequence Read Archive (SRA) for 10X VDJ data and analyzed 21 human and 23 murine datasets. We found that especially TRDV1, Trdv1 and to some extent Trdv2-2 are more commonly incorporated into TCR alpha chains than some TRAV genes, making the TRDV segments a relevant contribution to TCR alpha diversity. For apparently solitary beta chains in 10X VDJ datasets, we suggest to scrutinize the “all_contig_annotations” files as these may contain an accompanying, TRDV-containing alpha chain.