Positive allosteric modulators of the ionotropic glutamate receptor-2 (GluA2) are promising compounds for the treatment of cognitive disorders, e.g. Alzheimer's disease. These modulators bind within the dimer interface of the LBD (ligand-binding domain) and stabilize the agonist-bound conformation slowing receptor desensitization and/or deactivation. In the present study, we employ isothermal titration calorimetry to determine binding affinities and thermodynamic details of binding of modulators of GluA2. A mutant of the LBD of GluA2 (LBD-L483Y-N754S) that forms a stable dimer in solution was used. The potent GluA2 modulator BPAM-97 was used as a reference compound. Evidence that BPAM-97 binds in the same pocket as the well-known GluA2 modulator cyclothiazide was obtained from X-ray structures. The LBD-L483Y-N754S:BPAM-97 complex has a Kd of 5.6 μM (ΔH=-4.9 kcal/mol, -TΔS=-2.3 kcal/mol; where 1 kcal≈4.187 kJ). BPAM-97 was used in a displacement assay to determine a Kd of 0.46 mM (ΔH=-1.2 kcal/mol, -TΔS=-3.3 kcal/mol) for the LBD-L483Y-N754S:IDRA-21 complex. The major structural factors increasing the potency of BPAM-97 over IDRA-21 are the increased van der Waals contacts to, primarily, Met496 in GluA2 imposed by the ethyl substituent of BPAM-97. These results add important information on binding affinities and thermodynamic details, and provide a new tool in the development of drugs against cognitive disorders.

Neuronal α4β2 nicotinic acetylcholine receptors are attractive drug targets for psychiatric and neurodegenerative disorders and smoking cessation aids. Recently, a third agonist binding site between two α4 subunits in the (α4)₃(β2)₂ receptor subpopulation was discovered. In particular, three residues, H142, Q150, and T152, were demonstrated to be involved in the distinct pharmacology of the α4-α4 versus α4-β2 binding sites. To obtain insight into the three-dimensional structure of the α4-α4 binding site, a surrogate protein reproducing α4-α4 binding characteristics was constructed by introduction of three point mutations, R104H, L112Q, and M114T, into the binding pocket of Lymnaea stagnalis acetylcholine-binding protein (Ls-AChBP). Cocrystallization with two agonists possessing distinct pharmacologic profiles, NS3920 [1-(6-bromopyridin-3-yl)-1,4-diazepane] and NS3573 [1-(5-ethoxypyridin-3-yl)-1,4-diazepane], highlights the roles of the three residues in determining binding affinities and functional properties of ligands at the α4-α4 interface. Confirmed by mutational studies, our structures suggest a unique ligand-specific role of residue H142 on the α4 subunit. In the cocrystal structure of the mutated Ls-AChBP with the high-efficacy ligand NS3920, the corresponding histidine forms an intersubunit bridge that reinforces the ligand-mediated interactions between subunits. The structures further reveal that the binding site residues gain different and ligand-dependent interactions that could not be predicted based on wild-type Ls-AChBP structures in complex with the same agonists. The results show that an unprecedented correlation between binding in engineered AChBPs and functional receptors can be obtained and provide new opportunities for structure-based design of drugs targeting specific nicotinic acetylcholine receptor interfaces.

In purification of the ionotropic glutamate receptor A2 (GluA2) ligand‐binding domain ( LBD ), l ‐Glu‐supplemented buffers have previously been used for protein stabilization during the procedure. This sometimes hampers structural studies of low‐affinity ligands, because l ‐Glu is difficult to displace, despite extensive dialysis. Here, we show that l ‐Asp binds to full‐length GluA2 with low affinity ( K i = 0.63 m m ) and to the GluA2 LBD with even lower affinity ( K i = 2.6 m m ), and we use differential scanning fluorimetry to show that l ‐Asp is able to stabilize the isolated GluA2 LBD . We also show that l ‐Asp can replace l ‐Glu during purification, providing both equal yields and purity of the resulting protein sample. Furthermore, we solved three structures of the GluA2 LBD in the presence of 7.5, 50 and 250 m m l ‐Asp. Surprisingly, with 7.5 m m l ‐Asp, the GluA2 LBD crystallized as a mixed dimer, with l ‐Glu being present in one subunit, and neither l ‐Asp nor l ‐Glu being present in the other subunit. Thus, residual l ‐Glu is retained from the expression medium. On the other hand, only l ‐Asp was found at the binding site when 50 or 250 m m l ‐Asp was used for crystallization. The binding mode observed for l ‐Asp at the GluA2 LBD is very similar to that described for l ‐Glu. Taking our findings together, we have shown that l ‐Asp can be used instead of l ‐Glu for ligand‐dependent stabilization of the GluA2 LBD during purification. This will enable structural studies of low‐affinity ligands for lead optimization in structure‐based drug design. Database Structural data are available in the Protein Data Bank under accession numbers 4O3B (7.5 m m l ‐Asp), 4O3C (50 m m l ‐Asp), and 4O3A (250 m m l ‐Asp) Structured digital abstract GluA2 and GluA2 bind by x-ray crystallography ( View interaction )

Positive allosteric modulators of the ionotropic glutamate receptor A2 (GluA2) can serve as lead compounds for the development of cognitive enhancers. Several benzamide-type (S)-2-amino-3-(3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolyl)propionic acid (AMPA) receptor modulators such as aniracetam, CX516 and CX614 have been shown to inhibit the deactivation of AMPA receptors with a less pronounced effect on desensitization. Despite CX516 being an extensively investigated AMPA receptor modulator and one of the few clinically evaluated compounds, the binding mode of CX516 to AMPA receptors has not been reported. Here, the structures of a GluA2 ligand-binding domain mutant in complex with CX516 and the 3-methylpiperidine analogue of CX516 (Me-CX516) are reported. The structures show that the binding modes of CX516 and Me-CX516 are similar to those of aniracetam and CX614 and that there is limited space for substitution at the piperidine ring of CX516. The results therefore support that CX516, like aniracetam and CX614, modulates deactivation of AMPA receptors.

Ionotropic glutamate receptors are ligand-gated ion channels governing neurotransmission in the central nervous system. Three major types of antagonists are known for the AMPA-type receptor GluA2: competitive, noncompetitive (i.e., negative allosteric modulators; NAMs) used for treatment of epilepsy, and uncompetitive antagonists. We here report a 4.65 Å resolution X-ray structure of GluA2, revealing that four molecules of the competitive antagonist ZK200775 and four molecules of the NAM GYKI53655 are capable of binding at the same time. Using negative stain electron microscopy, we show that GYKI53655 alone or ZK200775/GYKI53655 in combination predominantly results in compact receptor forms. The agonist AMPA provides a mixed population of compact and bulgy shapes of GluA2 not impacted by addition of GYKI53655. Taken together, this suggests that the two different mechanisms of antagonism that lead to channel closure are independent and that the distribution between bulgy and compact receptors primarily depends on the ligand bound in the glutamate binding site. DATABASE: The atomic coordinates and structure factors from the crystal structure determination have been deposited in the Protein Data Bank under accession code https://doi.org/10.2210/pdb6RUQ/pdb. The electron microscopy 3D reconstruction volumes have been deposited in EMDB (EMD-4875: Apo; EMD-4920: ZK200775/GYKI53655; EMD-4921: AMPA compact; EMD-4922: AMPA/GYKI53655 bulgy; EMD-4923: GYKI53655; EMD-4924: AMPA bulgy; EMD-4925: AMPA/GYKI53655 compact).