Biofilms are extremely tolerant toward antimicrobial treatment and host immune clearance due to their distinct physiology and protection by extracellular polymeric substances. Bis-(3'-5')-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) is an essential messenger that regulates biofilm formation by a wide range of bacteria. However, there is a lack of physiological characterization of biofilms in vivo as well as the roles of c-di-GMP signaling in mediating host-biofilm interactions. Here, we employed dual RNA-Seq to characterize the host and pathogen transcriptomes during Pseudomonas aeruginosa infection using a mouse keratitis model. In vivo P. aeruginosa biofilms maintained a distinct physiology compared with in vitro P. aeruginosa biofilms, with enhanced virulence and iron uptake capacity. C-di-GMP synthesis was enhanced in P. aeruginosa cells in vivo, potentially due to down-regulation of the expression of several phosphodiesterases (e.g., DipA, NbdA). Increased intracellular c-di-GMP levels were required for long-term ocular colonization of P. aeruginosa and impaired host innate immunity.

Two Gram-stain-negative, aerobic, rod-shaped, non-endospore-forming bacteria, designated as strain MH1 T and MH2 T , were isolated from branches of wilted pepper plants ( Capsicum annuum ) collected from a farmland in Machong town, Guangdong, China, and investigated using a polyphasic approach. MH1 T grew at temperatures of 4–42 °C (optimum 28 °C), with 0–6.0 % (w/v) NaCl and at pH 4.0–10.0 (optimum pH 4.0). MH2 T grew at temperatures of 4–42 °C (optimum 28 °C), with 0–6.0% (w/v) NaCl and at pH 4.0–10.0 (optimum pH 5.0). Analysis of the 16S rRNA gene sequence indicated that MH1 T belongs to Stenotrophomonas and MH2 T belongs to Pseudomonas . Genome-based phylogenetic analysis further established that MH1 T shares the closest evolutionary relationships with Stenotrophomonas humi DSM 18929 and Stenotrophomonas terrae DSM 18941, and MH2 T is sister to Pseudomonas wayambapalatensis RW3S1. Whole-genome comparisons between MH1 T and known Stenotrophomonas species revealed average nucleotide identity (ANI) values up to 84.5%, as well as digital DNA–DNA hybridization (dDDH) values up to 28.3%, both substantially lower than the accepted thresholds for species delineation (ANI: 95%; dDDH: 70%). The ANI and dDDH values between MH2 T and known Pseudomonas species were at most 94.6 and 59.2 %, respectively. Additional biochemical and physiological analyses further support that MH1 T and MH2 T represent a novel species in Stenotrophomonas and Pseudomonas , respectively. Notably, the differences in carbon source utilization could differentiate MH1 T and its close relatives in Stenotrophomonas . The major fatty acids were iso-C 15 : 0 , iso-C 16 : 0 and iso-C 14 : 0 for MH1 T and were C 16 : 0 , C 18 : 1 ω7c/C 18 : 1 ω6c (summed feature 8), C 16 : 1 ω7c/C 16 : 1 ω6c (summed feature 3) and C 17 : 0 cyclo for MH2 T . Therefore, we propose a new species Stenotrophomonas capsici sp. nov., with MH1 T (=GDMCC 1.3749 T =JCM 36317 T ) as the type strain, and a new species Pseudomonas machongensis sp. nov., with MH2 T (=GDMCC 1.3750 T =JCM 36318 T ) as the type strain. The MH1 T genome has a size of 4.18 Mb and a GC-content of 67.19 mol%, while the MH2 T genome has a size of 5.71 Mb and a GC-content of 63.12 mol%.