Various methods to synthesize diverse nanoparticles with their different applications.

Sensory denervation of the corneal epithelium was obtained by circumscribed lesions of the trigeminal ganglion. Two physiological effects were found: an increase in epithelial permeability and a decreased ability to repair a standardized epithelial abrasion.

Many questions regarding the organization and the density of corneal intraepithelial terminals remain unanswered in spite of the extensive work that has been done on corneal innervation. In the present study, we employed light microscopic observations of gold-impregnated, serial cross-sections of rabbit cornea to document the assumed, but hitherto uncalculated high density of intraepithelial terminals. Our results showed that the innervation density of corneal epithelium was about 300–600 times that of skin and 20–40 times that of tooth pulp. The density of epithelial innervation was seen to decrease from the center of the cornea to the periphery. Serial cross-sections and flat mounts were used in the three-dimensional reconstruction of the organizational design of corneal terminals. From the subepithelial plexus, axons were seen to penetrate the epithelium, forming terminals that either diverged or branched vertically and horizontally. The vertical axons extended toward the outer cell layer. Horizontal axons developed into families of leashes with disorganized terminal branches and endings. The density and organizational geometry of corneal terminals, together with the correlations between their anatomical uniqueness and the types of sensations elicited by their stimulation, suggest that the cornea is a useful model for the study of experimental acute pain.

Fabrication of nanofibrous scaffolds with well-defined architecture mimicking native extracellular matrix analog has significant potentials for many specific tissue engineering and organs regeneration applications. The fabrication of aligned collagen nanofibrous scaffolds by electrospinning was described in this study. The structure and in vitro properties of these scaffolds were compared with a random collagen scaffold. All the collagen scaffolds were first crosslinked in glutaraldehyde vapor to enhance the biostability and keep the initial nano-scale dimension intact. From in vitro culture of rabbit conjunctiva fibroblast, the aligned scaffold exhibited lower cell adhesion but higher cell proliferation because of the aligned orientation of fibers when compared with the random scaffold. And the alignment of the fibers may control cell orientation and strengthen the interaction between the cell body and the fibers in the longitudinal direction of the fibers.

The tears, a critical body fluid of the surface of the eye, contain an unknown number of molecules including proteins/peptides, lipids, small molecule metabolites, and electrolytes. There have been continued efforts for exploring the human tear proteome to develop biomarkers of disease. In this study, we used the high speed TripleTOF 5600 system as the platform to analyze the human tear proteome from healthy subjects (3 females and 1 male, average age: 36 ± 14). We have identified 1543 proteins in the tears with less than 1% false discovery rate, which represents the largest number of human tear proteins reported to date. The data set was analyzed for gene ontology (GO) and compared with the human plasma proteome, NEIBank lacrimal gland gene dataset and NEIBank cornea gene dataset. This comprehensive tear protein list may serve as a reference list of human tear proteome for biomarker research of ocular diseases or establishment of MRM (Multiple Reaction Monitoring) assays for targeted analysis. Tear fluid is a useful and an accessible source not only for evaluating ocular surface tissues (cornea and conjunctiva), inflammation, lacrimal gland function and a number of disease conditions, such as dry eye as well as response to treatment.

The proteins found in tears have an important role in the maintenance of the ocular surface and changes in the quality and quantity of tear components reflect changes in the health of the ocular surface. In this study, we have used quantitative proteomics, iTRAQ technology coupled with 2D-nanoLC-nano-ESI-MS/MS and with a statistical model to uncover proteins that are significantly and reliably changed in the tears of dry eye patients in an effort to reveal potential biomarker candidates. Fifty-six patients with dry eye and 40 healthy subjects were recruited for this study. In total, 93 tear proteins were identified with a ProtScore ≥2 (≥99% confidence). Associated with dry eye were 6 up-regulated proteins, α-enolase, α-1-acid glycoprotein 1, S100 A8 (calgranulin A), S100 A9 (calgranulin B), S100 A4 and S100 A11 (calgizzarin) and 4 down-regulated proteins, prolactin-inducible protein (PIP), lipocalin-1, lactoferrin and lysozyme. Receiver operating curves (ROC) were evaluated for individual biomarker candidates and a biomarker panel. With the use of a 4-protein biomarker panel, the diagnostic accuracy for dry eye was 96% (sensitivity, 91.0%; specificity, 90.0%). Two biomarker candidates (α-enolase and S100 A4) generated from iTRAQ experiments were successfully verified using an ELISA assay. The levels of these 10 tear proteins reflect aqueous secretion deficiency by lacrimal gland, inflammatory status of the ocular surface. The clinical classification of the severity of the dry eye condition was successfully correlated to the proteomics by using three proteins that are associated with inflammation, α1-acid glycoprotein 1, S100 A8 and S100 A9. The nine tear protein biomarker candidates (except α1-acid glycoprotein 1) were also verified using an independent age-matched patient sample set. This study demonstrated that iTRAQ technology combined with 2D-nanoLC-nanoESI-MS/MS quantitative proteomics is a powerful tool for biomarker discovery.

Purpose.: The present study was designed to understand the role of inflammatory cytokines secreted by corneal epithelial cells in keratoconus (KC) and the response to treatment with cyclosporine A (CyA). Methods.: The study involved 129 Indian KC patients clinically graded according to Amsler-Krumeich classification and 20 healthy, nonectatic subjects as controls. Tear levels of matrix metalloproteinase-9 (MMP9), interleukin-6 (IL6), and tumor necrosis factor-α (TNFα) were measured using ELISA kits. Gene expression was measured by qPCR in corneal epithelial cells obtained by debridement from subjects undergoing ocular surface surgeries. In addition, epithelial cells were stimulated with TNFα and treated with CyA to study its role on MMP9 expression. Finally, 20 KC patients (27 eyes) with inflammatory symptoms were treated with topical CyA application. Results.: We observed that MMP9, TNFα, and IL6 levels were strongly upregulated at the mRNA level in KC patient epithelia. Similarly, tears collected from KC patients exhibited high levels of MMP9 and IL6 protein. Cyclosporine A treatment significantly reduced the mRNA expression levels of IL6 and TNFα in both short- and long-term treatments; however, it reduced MMP9 levels only in long-term treatment in cultured corneal epithelial cells. Subsequent treatment of KC patients with CyA for approximately 6 months reduced tear MMP9 levels and led to local reduction in corneal curvatures as determined by corneal topography maps. Conclusions.: The data indicate that corneal epithelium contributes to elevated MMP9 and inflammatory cytokine expression in tears of KC patients. Cyclosporine A treatment reduced MMP9 and inflammatory cytokine levels in an in vitro inflammation model system. In KC patients, CyA treatment reduced MMP9 levels measured in tears with concomitant arrest of disease progression. Therefore, CyA might be a novel treatment strategy in KC patients but requires additional evaluation in larger cohorts. (ClinicalTrials.gov number, NCT01746823.)

ABSTRACT Bacterial keratitis (BK) is a major cause of corneal blindness globally. This study aimed to develop a novel class of antimicrobial therapy, based on human-derived hybrid host defense peptides (HyHDPs), for treating BK. HyHDPs were rationally designed through combination of functional amino acids in parent HDPs, including LL-37 and human beta-defensin (HBD)-1 to −3. Minimal inhibitory concentrations (MICs) and time-kill kinetics assay were performed to determine the concentration- and time-dependent antimicrobial activity and cytotoxicity was evaluated against human corneal epithelial cells and erythrocytes. In vivo safety and efficacy of the most promising peptide was examined in the corneal wound healing and Staphylococcus aureus (ATCC SA29213) keratitis murine models, respectively. A second-generation HyHDP (CaD23), based on rational hybridization of the middle residues of LL-37 and C-terminal of HBD-2, was developed and was shown to demonstrate good efficacy against methicillin-sensitive and methicillin-resistant S. aureus [MIC=12.5-25.0μg/ml (5.2-10.4μM)] and S. epidermidis [MIC=12.5μg/ml (5.2μM)], and moderate efficacy against P. aeruginosa [MIC=25-50μg/ml (10.4-20.8μM)]. CaD23 (at 25μg/ml or 2x MIC) killed all the bacteria within 30 mins, which was 8 times faster than amikacin (25μg/ml or 20x MIC). After 10 consecutive passages, CaD23 did not develop any antimicrobial resistance (AMR) whereas amikacin, a commonly used treatment for BK, developed significant AMR (i.e. a 32-fold increase in MIC). Pre-clinical murine studies showed that CaD23 (0.5mg/ml) achieved a median reduction of S. aureus bioburden by 94% (or 1.2 log 10 CFU/ml) while not impeding corneal epithelial wound healing. In conclusion, rational hybridization of human-derived HDPs has led to generation of a potentially efficacious and safe topical antimicrobial agent for treating Gram-positive BK, with no/minimal risk of developing AMR.