ABSTRACT Cancers represent complex autonomous systems, displaying self-sufficiency in growth signaling. Autonomous growth is fueled by a cancer cell’s ability to ‘secrete-and-sense’ growth factors: a poorly understood phenomenon. Using an integrated systems and experimental approach, here we dissect the impact of a feedback-coupled GTPase circuit within the secretory pathway that imparts secretion-coupled autonomy. The circuit is assembled when the Ras-superfamily monomeric GTPase Arf1, and the heterotrimeric GTPase Giαβγ and their corresponding GAPs and GEFs are coupled by GIV/Girdin, a protein that is known to fuel aggressive traits in diverse cancers. One forward and two key negative feedback loops within the circuit create closed-loop control (CLC), allow the two GTPases to coregulate each other, and convert the expected switch-like behavior of Arf1-dependent secretion into an unexpected dose response alignment behavior of sensing and secretion. Such behavior translates into cell survival that is self-sustained by stimulus-proportionate secretion. Proteomic studies and protein-protein interaction network analyses pinpoint growth factors (e.g., the epidermal growth factor; EGF) as a key stimuli for such self-sustenance. Findings highlight how enhanced coupling of two biological switches in cancer cells is critical for multiscale feedback control to achieve secretion-coupled autonomy of growth factors. SYNOPSIS IMAGE STANDFIRST TEXT This work defines the inner workings of a Golgi-localized molecular circuitry comprised of coupled GTPases, which empowers cells to achieve self-sufficiency in growth factor signaling by creating a secrete-and-sense autocrine loop. HIGHLIGHTS/MAIN FINDINGS Modeling and experimental approaches were used to dissect a coupled GTPase circuit. Coupling enables closed loop feedback and mutual control of GTPases. Coupling generates dose response alignment behavior of sensing and secretion of growth factors. Coupling is critical for multiscale feedback control to achieve secretion-coupled autonomy.

Abstract Cellular proliferation is antagonistically regulated by canonical and non-canonical Wnt signals; their dysbalance triggers cancers. It is widely believed that the PI3-K→ Akt pathway enhances canonical Wnt signals by affecting transcriptional activity and stability of β-catenin. Here we demonstrate that the PI3-K→Akt pathway also enhances non-canonical Wnt signals by compartmentalizing β-catenin. By phosphorylating the phosphoinositide(PI)-binding domain of a multimodular signal transducer, Daple, Akt abolishes Daple’s ability to bind PI3-P-enriched endosomes that engage dynein motor complex for long-distance trafficking of β-catenin/E-cadherin complexes to pericentriolar recycling endosomes (PCREs). Phosphorylation compartmentalizes Daple/β-catenin/E-cadherin complexes to cell-cell contact sites, enhances non-canonical Wnt signals, and thereby, suppresses colony growth. Dephosphorylation compartmentalizes β-catenin on PCREs, a specialized compartment for prolonged unopposed canonical Wnt signaling, and enhances colony growth. Cancer-associated Daple mutants that are insensitive to Akt mimic a constitutively dephosphorylated state. This work not only identifies Daple as a platform for crosstalk between Akt and the non-canonical Wnt pathway, but also reveals the impact of such crosstalk during cancer initiation and progression.

A loss of balance between G-protein activation and deactivation has been implicated in the initiation of melanomas, and non-canonical Wnt signaling via the Wnt5A/Frizzled (FZD) pathway has been shown to be critical for the switch to an invasive phenotype. Daple [CCDC88C gene], a cytosolic guanine nucleotide exchange factor (GEF) which enhances non-canonical Wnt5A/FZD signaling via activation of trimeric G protein, Gαi has been shown to serve opposing roles -- as an inducer of EMT and invasiveness and a potent tumor suppressor -- via two isoforms, V1 (full-length) and V2, respectively. Here we report that the relative abundance of these isoforms in the peripheral circulation, presumably largely from circulating tumor cells (CTCs), is a prognostic marker of cutaneous melanomas. Expression of V1 is increased in both the early and late clinical stages (p<0.001, p=0.002, respectively); V2 is decreased exclusively in the late clinical stage (p=0.011). The two isoforms have opposing prognostic effects: high expression of V2 increases progression-free survival (PFS; p=0.02), whereas high expression of V1 decreases PFS (p=0.013). Furthermore, these effects are additive, in that melanoma patients with a low V2-high V1 signature carry the highest risk of metastatic disease. We conclude that detection of Daple transcripts in the peripheral blood (i.e., liquid biopsies) of patients with melanoma may serve as a prognostic marker and an effective strategy for non-invasive long-term follow-up of patients with melanoma.

Cellular proliferation, differentiation, and morphogenesis are shaped by multiple signaling cascades; their concurrent dysregulation plays an integral role in cancer progression and is a common feature of many malignancies. Three such cascades that contribute to the oncogenic potential are the Wnt/Frizzled(FZD), growth factor-receptor tyrosine kinases (RTKs), and G-proteins/GPCRs. Here we identify Daple, a modulator of trimeric G-proteins and a Dishevelled(Dvl)-binding protein as an unexpected point of convergence for all three cascades. Daple-dependent activation of Gαi and enhancement of non-canonical Wnt signals is not just triggered by Wnt5a/FZD to suppress tumorigenesis, but is also hijacked by growth factor-RTKs to fuel tumor progression. Phosphorylation of Daple by both RTKs and non-RTKs triggers Gαi activation and potentiates non-canonical Wnt signals that trigger epithelial-mesenchymal transition. In patients with colorectal cancers, concurrent upregulation of Daple and the prototype RTK, EGFR, carries poor prognosis. This work defines a novel growth factor↔G-protein↔Wnt crosstalk paradigm in cancer biology.

Abstract The molecular mechanisms by which receptor tyrosine kinases (RTKs) and heterotrimeric G proteins, two major signaling hubs in eukaryotes, independently relay signals across the plasma membrane have been extensively characterized. How these hubs crosstalk has been a long-standing question, but answers remain elusive. Using linear-ion-trap mass spectrometry in combination with biochemical, cellular, and computational approaches, we unravel a mechanism of activation of heterotrimeric G proteins by RTKs and chart the key steps that mediate such activation. Upon growth factor stimulation, the guanine-nucleotide exchange modulator, GIV, dissociates Gαi•βγ trimers, scaffolds monomeric Gαi with RTKs, and facilitates the phosphorylation on two tyrosines located within the inter-domain cleft of Gαi. Phosphorylation triggers the activation of Gαi and inhibits second messengers (cAMP). Tumor-associated mutants reveal how constitutive activation of this pathway impacts cell’s decision to ‘go’ vs . ‘grow’. These insights define a tyrosine-based G protein signaling paradigm and reveal its importance in eukaryotes. Significance Statement Growth factors and heterotrimeric G proteins are two of the most widely studied signaling pathways in eukaryotes; their crosstalk shapes some of the most fundamental cellular responses in both health and disease. Although mechanisms by which G protein pathways transactivate growth factor RTKs has been well-defined, how the reverse may happen is less understood. This study defines the key steps and cellular consequences of a fundamental mechanism of signal crosstalk that enables RTKs to transactivate heterotrimeric G protein, Gαi. Mutations found in tumors shed light on how derailing this mechanism impacts tumor cell behavior. Thus, findings not only show how cells integrate extracellular signals via pathway crosstalk, but also demonstrate the relevance of this pathway in cancers.

Summary By preserving progenitor characteristics, cell culture on soft hydrogel represents a practical tool in regenerative medicine compared with conventional rigid plastic. However, the mechanism by which the mechanical microenvironment determines progenitor phenotype, and its relevance to human biology, remain poorly described. Thanks to an innovation enabling the generation of uniform multi-well hydrogels, we show that 2D culture on mechanomimetic supports leads to an atypical S-phase quiescence and prevents cell drift, while preserving the differentiation capacities of human bronchoepithelial cells. Mechanistically, defects in proteostasis and basal endoplasmic reticulum stress (ERS) underlie the quiescent phenotype and resistance to ERS-induced apoptosis by metabolic stress. Furthermore, analysis of available single cell data of the human lung confirmed that these molecular features are consistent with those of pulmonary basal cells. Overall, this study demonstrates that mechanomimetic supports are relevant devices for characterizing novel molecular events that govern progenitor biology in human tissues.

Abstract Nutrient availability is a key determinant of tumor cell behavior. While nutrient-rich conditions favor proliferation and tumor growth, scarcity, and particularly glutamine starvation, promotes cell dedifferentiation and chemoresistance. Here, linking ribosome biogenesis plasticity with tumor cell fate, we uncover that the amino acid sensor GCN2 represses the expression of the precursor of ribosomal RNA, 47S, under metabolic stress. We show that blockade of GCN2 triggers cell death by an irremediable nucleolar stress and subsequent TP53-mediated apoptosis in patient-derived models of colon adenocarcinoma (COAD). In nutrient-rich conditions, GCN2 activity supports cell proliferation through the transcription stimulation of 47S rRNA, independently of the canonical ISR axis. However, impairment of GCN2 activity prevents nuclear translocation of the methionyl tRNA synthetase (MetRS) underlying the generation of a nucleolar stress, mTORC1 inhibition and autophagy induction. Inhibition of the GCN2-MetRS axis drastically improves the cytotoxicity of RNA pol I inhibitors, including the first-line chemotherapy oxaliplatin, on patient-derived COAD tumoroids. Our data thus reveal that GCN2 differentially controls the ribosome biogenesis according the nutritional context. Furthermore, pharmacological co-inhibition of the two GCN2 branches and the RNA pol I activity may represent a valuable strategy for elimination of proliferative and metabolically-stressed COAD cell.

Previously Aznar et al., showed that Daple enables Wnt/Frizzled receptors to transactivate trimeric G proteins during non-canonical Wnt signaling via a novel G-protein binding and activating (GBA) motif. By doing so, Daple serves as a double-edged sword; earlier during oncogenesis it suppresses neoplastic transformation and tumor growth, but later it triggers epithelial messenchymal transition (EMT). We have identified and characterized two isoforms of the human Daple/CCDC88c gene. While both isoforms cooperatively suppress tumor growth via their GBA motif, only the full-length transcript triggers EMT and invasion. Aspirin suppresses the full-length transcript and protein but upregulates the short isoform. Both isoforms are suppressed during colon cancer progression, and their reduced expression carries additive prognostic significance. These findings provide insights into the opposing roles of Daple during cancer progression and define the G protein regulatory GBA motif as one of the minimal modules essential for Daple's role as a tumor suppressor.