ABSTRACT The protist parasite Trypanosoma brucei has a single mitochondrion with a single unit genome termed kinetoplast DNA (kDNA). Faithfull segregation of replicated kDNA is ensured by a complicated structure termed tripartite attachment complex (TAC). The TAC physically links the basal body of the flagellum with the kDNA spanning the two mitochondrial membranes. Here, we characterized p166 as the only TAC subunit that is anchored in the inner membrane. Its C-terminal transmembrane domain separates the protein into a large N-terminal region that interacts with the kDNA-localized TAC102 and a 34 aa C-tail that binds to the intermembrane space-exposed loop of the integral outer membrane protein TAC60. Thus, in contrast to the outer membrane TAC region which requires four essential subunits for proper function a single inner membrane TAC subunit is sufficient to bridge the distance from the OM to the kDNA. Surprisingly, non-functional p166 lacking the C-terminal 34 aa still localizes to the TAC region. This suggests the existence of non-essential TAC-associated proteins in the OM. These proteins can loosely bind to non-functional p166 lacking the C-terminal 34 aa and keep it at the TAC but their binding would not be strong enough to withstand the mechanical force upon kDNA segregation. AUTHOR SUMMARY Mitochondria evolved from a single endosymbiotic event and are a hallmark of eukaryotes. The large majority of genes for mitochondrial proteins are nuclear encoded now and only a small number are found in the mitochondrial genome. The protist Trypanosoma brucei is an extreme eukaryote in many aspects. For instance, trypanosomes have a single mitochondrion and its genome – called kinetoplast DNA (kDNA) – locates as a single unit inside the mitochondrion close to the basal body of the flagellum. The tripartite attachment complex (TAC) forms a connection between the basal body and the kDNA ensuring faithful segregation of kDNA among the daughter cells upon cytokinesis. Recently, several TAC subunits of the cytoplasm, the outer mitochondrial membrane (OM) and the mitochondrial matrix have been characterized. Here, we identify p166 as the first TAC subunit of the inner mitochondrial membrane. It is anchored with a single transmembrane domain separating the protein into a N-terminal moiety located in the matrix and a short C-tail. The latter reaches into the intermembrane space and binds the OM subunit TAC60 whereas the N-terminus interacts with the matrix subunit TAC102. Thus, with p166 we identified the missing link required to connect different modules of the TAC.

Abstract Herein, we developed a single and a duplex TaqMan quantitative qPCR for absolute quantification of copy numbers of integrated dihydrofolate reductase-thymidylate synthase ( mdhfr-ts ) drug selectable marker for pyrimethamine resistance in Toxoplasma gondii knockouts (KOs). The single TaqMan qPCR amplifies a 174 bp DNA fragment of the inserted mdhfr-ts and of the wild-type (WT) dhfr-ts ( wt-dhfr-ts ) which is present as single copy gene in Toxoplasma and encodes a sensitive enzyme to pyrimethamine. Thus, the copy number of the dhfr-ts fragment in a given DNA quantity from KO parasites with a single site-specific integration should be twice the number of dhfr-ts copies recorded in the same DNA quantity from WT parasites. The duplex TaqMan qPCR allows simultaneous amplification of the 174 bp dhfr-ts fragment and the T. gondii 529-bp repeat element. Accordingly, for a WT DNA sample, the determined number of tachyzoites given by dhfr-ts amplification is equal to the number of tachyzoites determined by amplification of the Toxoplasma 529-bp , resulting thus in a ratio of 1. However, for a KO clone having a single site-specific integration of mdhfr-ts , the calculated ratio is 2. We then applied both approaches to test T. gondii RH mutants in which the major surface antigen (SAG1) was disrupted through insertion of mdhfr-ts using CRISPR-Cas9. Results from both assays were in correlation showing a high accuracy in detecting KOs with multiple integrated mdhfr-ts . Southern blot analyses using BsaBI and DraIII confirmed qPCRs results. Both TaqMan qPCRs are needed for reliable diagnostic of T. gondii KOs following CRISPR-Cas9-mediated mutagenesis, particularly with respect to off-target effects resulting from multiple insertions of mdhfr-ts . The principle of the duplex TaqMan qPCR is applicable for other selectable markers in Toxoplasma . TaqMan qPCR tools may contribute to more frequent use of WT Toxoplasma strains during functional genomics.

Mitochondria cannot form de novo but require mechanisms that mediate their inheritance to daughter cells. The parasitic protozoan Trypanosoma brucei has a single mitochondrion with a single-unit genome that is physically connected across the mitochondrial membranes to the basal body of the flagellum. This connection, termed tripartite attachment complex (TAC), is essential for the segregation of the replicated mitochondrial genomes prior to cytokinesis. Here we identify a protein complex consisting of three integral mitochondrial outer membrane proteins - TAC60, TAC42 and TAC40 - which are essential subunits of the TAC. TAC60 contains separable mitochondrial import and TAC-sorting signals and its biogenesis depends on the main outer membrane protein translocase. TAC40 is a member of the mitochondrial porin family, whereas TAC42 represents a novel class of mitochondrial outer membrane β-barrel proteins. Consequently TAC40 and TAC42 contain C-terminal β-signals. Thus in trypanosomes the highly conserved β-barrel protein assembly machinery plays a major role in the biogenesis of its unique mitochondrial genome segregation system.

Abstract The tripartite attachment complex (TAC) couples the segregation of the single unit mitochondrial DNA of trypanosomes with the basal body of the flagellum. Here we studied the architecture of the exclusion zone filament of the TAC that connects the basal body with the mitochondrial outer membrane. The only known component of the exclusion zone filaments is p197. Using genetical, biochemical and microscopical methods we show that p197 has three domains all of which are essential for mitochondrial DNA inheritance. The C-terminus of p197 interacts with the mature and pro-basal body whereas its N-terminus binds to the peripheral outer membrane protein TAC65. The large central region of p197 has a high α-helical content and likely acts as a flexible spacer. Replacement of endogenous p197 with a functional version containing N- and C-terminal epitope tags together with expansion microscopy demonstrates that p197 alone can bridge the approximately 170 nm gap between the basal body and the periphery of the outer membrane. This demonstrates the power of expansion microscopy which allows to localize distinct regions within the same molecule and suggests that p197 is the TAC subunit most proximal to the basal body. Significance statement Segregation of the replicated single unit mitochondrial genome of Trypanosoma brucei requires a large hardwired structure that connects the organellar DNA with the flagellar basal body. The cytosolic part of this structure consists of filaments made of single p197 molecules, a protein larger than 600 kDa. p197 has three domains all of which are essential for its function. The N-terminus of p197 is anchored to the peripheral outer membrane protein TAC65 whereas its C-terminus connects to the base of the basal body. The large central domain forms an α-helix and consists of at least 26 repeats of 175 aa in length. It provides a flexible linker bridging the approximately 170 nm between the outer membrane and the basal body

The parasitic protozoan Trypanosoma brucei has a single unit mitochondrial genome linked to the basal body of the flagellum via the tripartite attachment complex (TAC). The TAC is crucial for mitochondrial genome segregation during cytokinesis. At the core of the TAC, the outer membrane protein TAC60 binds to the inner membrane protein p166, forming a permanent contact site between the two membranes. Although contact sites between mitochondrial membranes are common and serve various functions, their molecular architecture remains largely unknown. This study elucidates the interaction interface of the TAC60-p166 contact site. Using in silico , in vitro , and mutational in vivo analyses, we identified minimal binding segments between TAC60 and p166. The p166 binding site in TAC60 consists of a short kinked α-helix that interacts with the C-terminal α-helix of p166. Despite the presence of conserved charged residues in either protein, electrostatic interactions are not necessary for contact site formation. Instead, the TAC60-p166 interaction is driven by the hydrophobic effect, as converting conserved hydrophobic residues in either protein to hydrophilic amino acids disrupts the contact site.