Abstract Spinal cord injury leads to a massive response of innate immune cells in non-regenerating mammals, but also in successfully regenerating zebrafish. However, the role of the immune response in successful regeneration is poorly defined. Here we show that inhibiting inflammation reduces and promoting it accelerates axonal regeneration in spinal-lesioned zebrafish larvae. Mutant analyses show that peripheral macrophages, but not neutrophils or microglia, are necessary for repair. Macrophage-less irf8 mutants show prolonged inflammation with elevated levels of Tnf-α and Il-1β. Inhibiting Tnf-α does not rescue axonal growth in irf8 mutants, but impairs it in wildtype animals, indicating a pro-regenerative role of Tnf-α. In contrast, decreasing Il-1β levels or number of Il-1β + neutrophils rescue functional regeneration in irf8 mutants. However, during early regeneration, interference with Il-1β function impairs regeneration in irf8 and wildtype animals. Hence, inflammation is dynamically controlled by macrophages to promote functional spinal cord regeneration in zebrafish.

ABSTRACT Acute CRISPR/Cas9 targeting offers the opportunity for scalable phenotypic genetic screening in zebrafish. However, the unpredictable efficiency of CRISPR gRNA (CrRNA) activity is a limiting factor. Here we describe how to resolve this by prescreening CrRNAs for high activity in vivo , using a simple standardised assay based on restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP). We targeted 350 genomic sites with synthetic RNA Oligo guide RNAs (sCrRNAs) in zebrafish embryos and found that almost half exhibited > 90% efficiency in our RFLP assay. Having the ability to preselect highly active sCrRNAs (haCRs), we carried out a focussed phenotypic screen of 30 macrophage-related genes in spinal cord regeneration and found 10 genes whose disruption impaired axonal regeneration. Four ( tgfb1a, tgfb3, tnfa, sparc ) out of 5 stable mutants subsequently analysed retained the acute haCR phenotype, validating the efficiency of this approach. Mechanistically, lack of tgfb1a leads to a prolonged immune response after injury, which inhibits regeneration. Our rapid and scalable screening approach has identified functional regulators of spinal cord regeneration, and can be applied to study any biological function of interest. HIGHLIGHTS - Synthetic CRISPR gRNAs are highly active - in vivo pre-screening allows rapid assessment of CRISPR gRNA activity - Phenotypic CRISPR screen reveals crucial genes for spinal cord regeneration - tgfb1a promotes spinal regeneration by controlling inflammation

Spinal cord injury leads to a massive response of innate immune cells (microglia, macrophages, neutrophils) both, in non-regenerating mammals and in successfully regenerating zebrafish, but the role of these immune cells in functional spinal cord regeneration in zebrafish has not been addressed. Here we show that inhibiting inflammation reduces and promoting it accelerates axonal regeneration in larval zebrafish. Mutant analyses show that peripheral macrophages, but not neutrophils or microglia, are necessary and sufficient for full regeneration. Macrophage-less irf8 mutants show prolonged inflammation with elevated levels of Il-1β and Tnf-α. Decreasing Il-1β levels or number of Il-1β+ neutrophils rescues functional regeneration in irf8 mutants. However, during early regeneration, interference with Il-1β function impairs regeneration in irf8 and wildtype animals. Inhibiting Tnf-α does not rescue axonal growth in irf8 mutants, but impairs it in wildtype animals, indicating a pro-regenerative role of Tnf-α. Hence, inflammation is tightly and dynamically controlled by macrophages to promote functional spinal cord regeneration in zebrafish.