Abstract Spinal cord injury leads to a massive response of innate immune cells in non-regenerating mammals, but also in successfully regenerating zebrafish. However, the role of the immune response in successful regeneration is poorly defined. Here we show that inhibiting inflammation reduces and promoting it accelerates axonal regeneration in spinal-lesioned zebrafish larvae. Mutant analyses show that peripheral macrophages, but not neutrophils or microglia, are necessary for repair. Macrophage-less irf8 mutants show prolonged inflammation with elevated levels of Tnf-α and Il-1β. Inhibiting Tnf-α does not rescue axonal growth in irf8 mutants, but impairs it in wildtype animals, indicating a pro-regenerative role of Tnf-α. In contrast, decreasing Il-1β levels or number of Il-1β + neutrophils rescue functional regeneration in irf8 mutants. However, during early regeneration, interference with Il-1β function impairs regeneration in irf8 and wildtype animals. Hence, inflammation is dynamically controlled by macrophages to promote functional spinal cord regeneration in zebrafish.

ABSTRACT Adult zebrafish regenerate neurons in their brain, but the extent and variability of this capacity is unclear. Here we ask whether loss of various dopaminergic neuron populations is sufficient to trigger their functional regeneration. Genetic lineage tracing shows that specific diencephalic ependymo-radial glial progenitor cells (ERGs) give rise to new dopaminergic (Th + ) neurons. Ablation elicits an immune response, increased proliferation of ERGs and increased addition of new Th + neurons in populations that constitutively add new neurons, e.g. diencephalic population 5/6. Inhibiting the immune response attenuates neurogenesis to control levels. Boosting the immune response enhances ERG proliferation, but not addition of Th + neurons. In contrast, in populations in which constitutive neurogenesis is undetectable, e.g. the posterior tuberculum and locus coeruleus, cell replacement and tissue integration are incomplete and transient. This is associated with loss of spinal Th + axons, as well as permanent deficits in shoaling and reproductive behaviour. Hence, dopaminergic neuron populations in the adult zebrafish brain show vast differences in regenerative capacity that correlate with constitutive addition of neurons and depend on immune system activation.

Spinal cord injury leads to a massive response of innate immune cells (microglia, macrophages, neutrophils) both, in non-regenerating mammals and in successfully regenerating zebrafish, but the role of these immune cells in functional spinal cord regeneration in zebrafish has not been addressed. Here we show that inhibiting inflammation reduces and promoting it accelerates axonal regeneration in larval zebrafish. Mutant analyses show that peripheral macrophages, but not neutrophils or microglia, are necessary and sufficient for full regeneration. Macrophage-less irf8 mutants show prolonged inflammation with elevated levels of Il-1β and Tnf-α. Decreasing Il-1β levels or number of Il-1β+ neutrophils rescues functional regeneration in irf8 mutants. However, during early regeneration, interference with Il-1β function impairs regeneration in irf8 and wildtype animals. Inhibiting Tnf-α does not rescue axonal growth in irf8 mutants, but impairs it in wildtype animals, indicating a pro-regenerative role of Tnf-α. Hence, inflammation is tightly and dynamically controlled by macrophages to promote functional spinal cord regeneration in zebrafish.

Excessive reactive oxygen species (ROS) can damage proteins, lipids, and DNA, which result in cell damage and death. The outcomes can be acute, as seen in stroke, or more chronic as observed in age-related diseases such as Parkinson's disease. Here we investigate the antioxidant ability of a novel synthetic flavonoid, Proxison (7-decyl-3-hydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-4-chromenone), using a range of in vitro and in vivo approaches. We show that, while it has radical scavenging ability on par with other flavonoids in a cell-free system, Proxison is orders of magnitude more potent than natural flavonoids at protecting neural cells against oxidative stress and is capable of rescuing damaged cells. The unique combination of a lipophilic hydrocarbon tail with a modified polyphenolic head group promotes efficient cellular uptake and mitochondrial localisation of Proxison. Importantly, in vivo administration of Proxison demonstrated effective and well tolerated neuroprotection against oxidative stress in a zebrafish model of dopaminergic neuronal loss.

G4C2 Hexanucleotide repeat expansions within the gene C9ORF72 are the most common cause of the neurodegenerative diseases Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Frontotemporal dementia (FTD). This disease-causing expansion leads to a reduction in C9ORF72 expression levels in patients, suggesting haploinsufficiency could contribute to disease. To further understand the consequences of C9ORF72 deficiency in vivo, we generated a c9orf72 mutant zebrafish line. Analysis of the spinal cord revealed no appreciable neurodegenerative pathology such as loss of motor neurons, or increased levels of neuroinflammation. However, detailed examination of c9orf72-/- retinas showed prominent neurodegenerative features, including a decrease in retinal thickness, gliosis, and an overall reduction in neurons of all subtypes. Structurally, analysis of rod and cone cells within the photoreceptor layer showed a disturbance in the outer cells of the retina and rhodopsin mis-localisation from rod outer segments to their cell bodies and synaptic endings. Thus, C9ORF72 may play a previously unappreciated role in retinal homeostasis and suggests C9ORF72 deficiency can induce tissue specific neuronal loss.

Wound closure after a brain injury is critical for tissue restoration but this process is still not well characterised at the tissue level. We use live observation of wound closure in larval zebrafish after inflicting a stab wound to the brain. We demonstrate that the wound closes in the first 24 hours after injury by global tissue contraction. Microglia accumulation at the point of tissue convergence precedes wound closure and computational modelling of this process indicates that physical traction by microglia could lead to wound closure. Indeed, genetically or pharmacologically depleting microglia leads to defective tissue repair. Live observations indicate centripetal deformation of astrocytic processes contacted by migrating microglia. Severing such contacts leads to retraction of cellular processes, indicating tension. Weakening tension by disrupting the F-actin stabilising gene lcp1 in microglial cells, leads to failure of wound closure. Therefore, we propose a previously unidentified mechanism of brain repair in which microglia has an essential role in contracting spared tissue. Understanding the mechanical role of microglia will support advances in traumatic brain injury therapies Graphical Abstract

ABSTRACT Acute CRISPR/Cas9 targeting offers the opportunity for scalable phenotypic genetic screening in zebrafish. However, the unpredictable efficiency of CRISPR gRNA (CrRNA) activity is a limiting factor. Here we describe how to resolve this by prescreening CrRNAs for high activity in vivo , using a simple standardised assay based on restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP). We targeted 350 genomic sites with synthetic RNA Oligo guide RNAs (sCrRNAs) in zebrafish embryos and found that almost half exhibited > 90% efficiency in our RFLP assay. Having the ability to preselect highly active sCrRNAs (haCRs), we carried out a focussed phenotypic screen of 30 macrophage-related genes in spinal cord regeneration and found 10 genes whose disruption impaired axonal regeneration. Four ( tgfb1a, tgfb3, tnfa, sparc ) out of 5 stable mutants subsequently analysed retained the acute haCR phenotype, validating the efficiency of this approach. Mechanistically, lack of tgfb1a leads to a prolonged immune response after injury, which inhibits regeneration. Our rapid and scalable screening approach has identified functional regulators of spinal cord regeneration, and can be applied to study any biological function of interest. HIGHLIGHTS - Synthetic CRISPR gRNAs are highly active - in vivo pre-screening allows rapid assessment of CRISPR gRNA activity - Phenotypic CRISPR screen reveals crucial genes for spinal cord regeneration - tgfb1a promotes spinal regeneration by controlling inflammation