Abstract Membrane lipid composition is a critical feature of cell function, where cholesterol is a major lipid sterol component that influences the membranes physical and electrical properties. The effects of cholesterol on transport properties between adjacent to the cells, especially in junctions formed between cells is not completely understood. These junctions where substances transport and signaling is critical may be affected by modifying the cholesterol composition of the membrane in these junctional regions. Here we show how the cholesterol content in a membrane can regulate these phenomena by changing their effect on transport into and through regions between cell membranes in close proximity. Through geometric and electrostatic effects interaction with substrates, the properties of the fluid between membranes are shown to potentially enforce concentration gradients of dissolved compounds that may be biologically significant.

Microglia function is orchestrated through highly-coupled signaling pathways that depend on calcium (Ca2+). In response to extracellular ATP, transient increases in intracellular Ca2+ driven through the activation of purinergic receptors, P2X and P2Y, are sufficient to promote cytokine synthesis and potentially their release. While steps comprising the pathways bridging purinergic receptor activation with transcriptional responses have been probed in great detail, a quantitative model for how these steps collectively control cytokine production has not been established. Here we developed a minimal computational model that quantitatively links extracellular stimulation of two prominent ionotropic purinergic receptors, P2X4 and P2X7, with the graded production of a gene product, namely the TNFα cytokine. In addition to Ca2+ handling mechanisms common to eukaryotic cells, our model includes microglia-specific processes including ATP-dependent P2X4 and P2X7 activation, activation of NFAT transcription factors, and TNFα production. Parameters for this model were optimized to reproduce published data for these processes, where available. With this model, we determined the propensity for TNFα production in microglia, subject to a wide range of ATP exposure amplitudes, frequencies and durations that the cells could encounter in vivo. Furthermore, we have investigated the extent to which modulation of the signal transduction pathways influence TNFα production. Our key findings are that TNFα production via P2X4 is maximized at low ATP when subject to high frequency ATP stimulation, whereas P2X7 contributes most significantly at millimolar ATP ranges. Given that Ca2+ homeostasis in microglia is profoundly important to its function, this computational model provides a quantitative framework to explore hypotheses pertaining to microglial physiology.

Calcineurin (CaN) is a calcium-dependent phosphatase involved in numerous signaling pathways. Its activation by Ca2+ is in part driven by binding of calmodulin (CaM) to a CaM-recognition motif within the phosphatase's regulatory domain (RD); however, secondary interactions between CaM and the CaN regulatory domain may be necessary to fully activate CaN (Biochemistry 52.(2013), 8643-8651). Specifically, it has been shown that the CaN regulatory domain folds upon CaM binding and that there is a region C-terminal to the canonical CaM-binding region, the 'distal helix', that assumes an alpha helix fold and contributes to activation (Biochemistry 52.(2013), 8643-8651). We hypothesized in Dunlap et al (Biochemistry 52.(2013), 8643-8651) that this putative alpha helical distal helix is capable of binding CaM in a region distinct from the canonical CaM binding region (CaMBR) site, whereby CaN is activated. To test this hypothesis, we utilized molecular simulations including replica-exchange molecular dynamics, protein-protein docking and computational mutagenesis to model distal helix conformations. From these simulations we have isolated a potential binding site on CaM (site D) that facilitates moderate affinity inter-protein interactions that may attenuate CaN auto-inhibition. Further, molecular simulations of the distal helix A454E mutation demonstrated weakened distal helix/CaM interactions that were previously shown to impair CaN activity. K30E and G40D mutations of CaM at site D presented similar decreases in binding affinity predicted by simulations. The prediction was correlated with a phosphatase assay in which these two mutants show reduced CaN activity. This study therefore provides a potential structural basis for the role of secondary CaM/CaN interactions in mediating CaN activation.