The human malaria parasite Plasmodium vivax is responsible for 25–40% of the ∼515 million annual cases of malaria worldwide. Although seldom fatal, the parasite elicits severe and incapacitating clinical symptoms and often causes relapses months after a primary infection has cleared. Despite its importance as a major human pathogen, P. vivax is little studied because it cannot be propagated continuously in the laboratory except in non-human primates. We sequenced the genome of P. vivax to shed light on its distinctive biological features, and as a means to drive development of new drugs and vaccines. Here we describe the synteny and isochore structure of P. vivax chromosomes, and show that the parasite resembles other malaria parasites in gene content and metabolic potential, but possesses novel gene families and potential alternative invasion pathways not recognized previously. Completion of the P. vivax genome provides the scientific community with a valuable resource that can be used to advance investigation into this neglected species. Four distinct Plasmodium species are known to regularly infect humans: Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae and P. ovale. The genome sequence of P. falciparum, the cause of the most severe type of human malaria, was completed in 2002 at the same time as the mosquito vector, Anopheles gambiae. In this week's Nature, which focuses on the malaria parasite, two further malaria genome sequences are described. First that of P. vivax, which contributes significant numbers to malaria incidence in humans, though in contrast to P. falciparum, the resulting disease is usually not fatal. The genome of this rather neglected species is presented together with a comparative analysis with the genomes of other Plasmodium species. Second, we publish the genome sequence of Plasmodium knowlesi. For long regarded as a monkey malaria parasite, it is increasingly becoming recognized as the fifth human-infecting Plasmodium species. In particular, it is prevalent in South East Asia where it is often misdiagnosed as another human malaria parasite P. malariae. As a model organism P. knowlesi stands out: not only is it a primate system, useful for work on vaccines, but it can be cultured in vitro and subjected to efficient transfection and gene knockouts. In a Review Article, Elizabeth Winzeler considers the progress made towards using the genome sequence to understand basic malaria parasite biology, and in particular the work on developing rational therapeutic approaches to combat P. falciparum infections. See also the Editorial. For a comprehensive collection of resources visit Nature's past malaria specials: Malaria killer blow ; Outlook on malaria ; Malaria web focus ; Malaria Insight ; Nature Medicine focus on malaria ; Focus on malaria

Several hundred malaria parasite proteins are exported beyond an encasing vacuole and into the cytosol of the host erythrocyte, a process that is central to the virulence and viability of the causative Plasmodium species. The trafficking machinery responsible for this export is unknown. Here we identify in Plasmodium falciparum a translocon of exported proteins (PTEX), which is located in the vacuole membrane. The PTEX complex is ATP-powered, and comprises heat shock protein 101 (HSP101; a ClpA/B-like ATPase from the AAA+ superfamily, of a type commonly associated with protein translocons), a novel protein termed PTEX150 and a known parasite protein, exported protein 2 (EXP2). EXP2 is the potential channel, as it is the membrane-associated component of the core PTEX complex. Two other proteins, a new protein PTEX88 and thioredoxin 2 (TRX2), were also identified as PTEX components. As a common portal for numerous crucial processes, this translocon offers a new avenue for therapeutic intervention.

ABSTRACT The development of effective malaria vaccines remains a global health priority. Currently, the most advanced vaccine, known as RTS,S, has only shown modest efficacy in clinical trials. Thus, the development of more efficacious vaccines by improving the formulation of RTS,S for increased efficacy or to interrupt malaria transmission are urgently needed. The RTS,S vaccine is based on the presentation of a fragment of the sporozoite antigen on the surface of virus-like particles (VLPs) based on human hepatitis B virus (HBV). In this study, we have developed and evaluated a novel VLP platform based on duck HBV (known as Metavax) for malaria vaccine development. This platform can incorporate large and complex proteins into VLPs and is produced in a Hansenula cell line compatible with cGMP vaccine production. Here, we have established the expression of leading P. falciparum malaria vaccine candidates as VLPs. This includes Pfs230 and Pfs25, which are candidate transmission-blocking vaccine antigens. We demonstrated that the VLPs effectively induce antibodies to malaria vaccine candidates with minimal induction of antibodies to the duck-HBV scaffold antigen. Antibodies to Pfs230 also recognised native protein on the surface of gametocytes, and antibodies to both Pfs230 and Pfs25 demonstrated transmission-reducing activity in standard membrane feeding assays. These results establish the potential utility of this VLP platform for malaria vaccines, which may be suitable for the development of multi-component vaccines that achieve high vaccine efficacy and transmission-blocking immunity.

Abstract With resistance to most antimalarials increasing, it is imperative that new drugs are developed. We previously identified an aryl acetamide compound, MMV006833 (M-833), that inhibited the ring-stage development of newly invaded merozoites. Here, we select parasites resistant to M-833 and identify mutations in the START lipid transfer protein (PF3D7_0104200, Pf START1). Introducing Pf START1 mutations into wildtype parasites reproduces resistance to M-833 as well as to more potent analogues. Pf START1 binding to the analogues is validated using organic solvent-based Proteome Integral Solubility Alteration (Solvent PISA) assays. Imaging of invading merozoites shows the inhibitors prevent the development of ring-stage parasites potentially by inhibiting the expansion of the encasing parasitophorous vacuole membrane. The Pf START1-targeting compounds also block transmission to mosquitoes and with multiple stages of the parasite’s lifecycle being affected, Pf START1 represents a drug target with a new mechanism of action.

Abstract With emerging resistance to frontline treatments, it is vital that new antimalarial drugs are identified to target Plasmodium falciparum . We have recently described a compound, MMV020291, as a specific inhibitor of red blood cell invasion, and have generated analogues with improved potency. Here, we identify actin and profilin as putative targets of the MMV020291 series through resistance selection and whole genome sequencing of three MMV020291 resistant populations. This revealed three non-synonymous single nucleotide polymorphisms in two genes; two in profilin (N154Y, K124N) and a third one in actin-1 (M356L). Using CRISPR-Cas9, we engineered these mutations into wildtype parasites which rendered them resistant to MMV020291. We demonstrate that MMV020291 reduces actin polymerisation that is required by the merozoite stage parasites to invade red blood cells. Additionally, the series inhibits the actin-1 dependent process of apicoplast segregation, leading to a delayed death phenotype. In vitro co-sedimentation experiments using recombinant P. falciparum actin-1 and profilin proteins indicate that potent MMV020291 analogues amplify the actin-monomer sequestering effect of profilin, thereby reducing the formation of filamentous actin. Altogether, this study identifies the first compound series targeting the actin-1/profilin interaction in P. falciparum and paves the way for future antimalarial development against the highly dynamic process of actin polymerisation.

Malaria parasites remodel their host erythrocytes to gain nutrients and avoid the immune system. Host erythrocytes are modified by hundreds of effectors proteins exported from the parasites into the host cell. Protein export is mediated by the PTEX translocon comprising five core components of which EXP2 is considered to form the putative pore that spans the vacuole membrane enveloping the parasite within its erythrocyte. To explore the function and importance of EXP2 for parasite survival in the asexual blood stage of Plasmodium falciparum we inducibly knocked down the expression of EXP2. Reduction in EXP2 expression strongly reduced parasite growth proportional to the degree of protein knockdown and tended to stall development about half way through the asexual cell cycle. Once the knockdown inducer was removed and EXP2 expression restored, parasite growth recovered dependent upon the length and degree of knockdown. To establish EXP2 function and hence the basis for growth reduction, the trafficking of an exported protein was monitored following EXP2 knockdown. This resulted in severe attenuation of protein export and is consistent with EXP2, and PTEX in general, being the conduit for export of proteins into the host compartment.

Abstract We describe an MHC II (IA b )-restricted T cell receptor (TCR) transgenic mouse line that produces CD4 + T cells specific for Plasmodium species. This line, termed PbT-II, was derived from a CD4 + T cell hybridoma generated to blood-stage Plasmodium berghei ANKA (PbA). PbT-II cells responded to all Plasmodium species and stages tested so far, including rodent (PbA, P. berghei NK65, P. chabaudi AS and P. yoelii 17XNL) and human ( P . falciparum) blood-stage parasites as well as irradiated PbA sporozoites. PbT-II cells can provide help for generation of antibody to P. chabaudi infection and can control this otherwise lethal infection in CD40L-deficient mice. PbT-II cells can also provide help for development of CD8 + T cell-mediated experimental cerebral malaria (ECM) during PbA infection. Using PbT-II CD4+ T cells and the previously described PbT-I CD8 + T cells, we determined the dendritic cell (DC) subsets responsible for immunity to PbA blood-stage infection. CD8 + DC (a subset of XCR1 + DC) were the major antigen presenting cell (APC) responsible for activation of both T cell subsets, though other DC also contributed to CD4 + T cell responses. Depletion of CD8 + DC at the beginning of infection prevented ECM development and impaired both Th1 and Tfh responses; in contrast, late depletion did not affect ECM. This study describes a novel and versatile tool for examining CD4 + T cell immunity during malaria and provides evidence that CD4 + T cell help, acting via CD40L signalling, can promote immunity or pathology to blood stage malaria largely through antigen presentation by CD8 + DC.

Abstract The Plasmodium falciparum reticulocyte-binding protein homolog 5 (PfRH5) is the current leading blood-stage malaria vaccine candidate. PfRH5 functions as part of the pentameric PCRCR complex containing PTRAMP, CSS, PfCyRPA and PfRIPR, all of which are essential for infection of human red blood cells (RBCs). To trigger RBC invasion, PfRH5 engages with RBC protein basigin in a step termed the RH5-basigin binding stage. Although we know increasingly more about how antibodies specific for PfRH5 can block invasion, much less is known about how antibodies recognizing other members of the PCRCR complex can inhibit invasion. To address this, we performed live cell imaging using monoclonal antibodies (mAbs) which bind PfRH5 and PfCyRPA. We measured the degree and timing of the invasion inhibition, the stage at which it occurred, as well as subsequent events. We show that parasite invasion is blocked by individual mAbs, and the degree of inhibition is enhanced when combining a mAb specific for PfRH5 with one binding PfCyRPA. In addition to directly establishing the invasion-blocking capacity of the mAbs, we identified a secondary action of certain mAbs on extracellular parasites that had not yet invaded where the mAbs appeared to inactivate the parasites by triggering a developmental pathway normally only seen after successful invasion. These findings suggest that epitopes within the PfCyRPA-PfRH5 sub-complex that elicit these dual responses may be more effective immunogens than neighboring epitopes by both blocking parasites from invading and rapidly inactivating extracellular parasites. These two protective mechanisms, prevention of invasion and inactivation of uninvaded parasites, resulting from antibody to a single epitope indicate a possible route to the development of more effective vaccines. Author Summary Malaria is a sometimes-fatal disease caused by protozoan parasites of which Plasmodium falciparum is the most deadly species that causes hundreds of millions of infections and half a million deaths per year. A partially effective vaccine is available to block parasite forms transmitted by mosquitoes but not the subsequent blood stage which causes symptomatic disease. To fight blood stage parasites, proteins have been identified such as PfRH5, that aid parasite entry into human red blood cells (RBCs) and vaccines made from these proteins can trigger the production of antibodies that bind the parasite proteins thereby blocking RBC invasion. PfRH5 forms a complex with another parasite protein called PfCyRPA and together antibodies to PfCyRPA and PfRH5 are highly effective in reducing parasite growth. Here we investigated how antibodies to PfCyRPA and PfRH5 actually block invasion using video microscopy of live parasites. As anticipated, we found the antibodies not only stopped most parasites from invading but of those parasites that did invade, they took longer to do so, suggesting the antibodies were physically inhibiting the invasion process. One unanticipated effect of both PfRH5 antibodies and one of three PfCyRPA antibodies tested, was that they triggered the uninvaded parasites to change into cellular forms normally only seen inside RBCs. These intracellular forms are no longer competent to invade and so the PfRH5/CyRPA antibodies have the potential of both neutralize parasites by physically preventing RBC entry and by changing the parasites into invasion incompetent forms.

Abstract M5717 is a promising antimalarial drug under development thatacts against multiple stages of the life cycle of Plasmodium parasites by inhibiting the translation elongation factor 2 ( Pf eEF2), thereby preventing protein synthesis. The parasite clearance profile after drug treatment in preclinical studies in mice, and clinical trials in humans showed a notable delayed clearance phenotype whereby parasite infected red blood cells (iRBCs) persisted in the bloodstream for a significant period before eventual clearance. In a normal P. falciparum infection iRBCs sequester in the deep circulation by cytoadherence, allowing them to avoid surveillance and clearance in the spleen. In this work we show that M5717 treatment renders iRBCs invisible to normal splenic clearance mechanisms. We found that M5717 blocks parasite modification of their host red blood cells (RBCs) by preventing synthesis of new exported proteins, rather than by directly blocking the export of these proteins into the RBC compartment. Using in vitro models, we demonstrated that M5717 treated ring/trophozoite stage iRBCs became less rigid, and cytoadhered less well compared to untreated iRBCs. This indicates that in vivo persistence of M5717 treated iRBCs in the blood stream is likely due to reduced cytoadherence and splenic clearance.

ABSTRACT With resistance increasing to current antimalarial medicines, there is an urgent need to discover new drug targets and to develop new medicines against these targets. We therefore screened the Open Global Health Library of Merck KGaA, Darmstadt, Germany of 250 compounds against the asexual blood stage of the deadliest malarial parasite Plasmodium falciparum, from which eight inhibitors with low micromolar potency were found. Due to its combined potencies against parasite growth and inhibition of red blood cell invasion, the pyridyl-furan compound OGHL250, was prioritised for further optimisation. The potency of the series lead compound (WEHI-518) was improved 250-fold to low nanomolar levels against parasite blood-stage growth. Parasites selected for resistance to a related compound MMV396797, were also resistant to WEHI-518 as well as KDU731, an inhibitor of the phosphatidylinositol kinase PfPI4KIIIB, suggesting this kinase is the target of the pyridyl-furan series. Inhibition of PfPI4KIIIB blocks multiple stages of the parasite’s life cycle and other potent inhibitors are currently under preclinical development. MMV396797-resistant parasites possess an E1316D mutation in PfPKI4IIIB which clusters with known resistance mutations of other inhibitors of the kinase. Building upon earlier studies which showed that PfPI4KIIIB inhibitors block the development of the invasive merozoite parasite stage, we show that members of the pyridyl-furan series also block invasion and/or the conversion of merozoites into ring-stage intracellular parasites through inhibition of protein secretion and export into red blood cells.