Polyploidization has provided much genetic variation for plant adaptive evolution, but the mechanisms by which the molecular evolution of polyploid genomes establishes genetic architecture underlying species differentiation are unclear. Brassica is an ideal model to increase knowledge of polyploid evolution. Here we describe a draft genome sequence of Brassica oleracea, comparing it with that of its sister species B. rapa to reveal numerous chromosome rearrangements and asymmetrical gene loss in duplicated genomic blocks, asymmetrical amplification of transposable elements, differential gene co-retention for specific pathways and variation in gene expression, including alternative splicing, among a large number of paralogous and orthologous genes. Genes related to the production of anticancer phytochemicals and morphological variations illustrate consequences of genome duplication and gene divergence, imparting biochemical and morphological variation to B. oleracea. This study provides insights into Brassica genome evolution and will underpin research into the many important crops in this genus. Brassica oleracea is plant species comprising economically important vegetable crops. Here, the authors report the draft genome sequence of B. oleracea and, through a comparative analysis with the closely related B. rapa, reveal insights into Brassicaevolution and divergence of interspecific genomes and intraspecific subgenomes.

The relative ease, speed, and biological scope of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated Protein9 (Cas9)-based reagents for genomic manipulations are revolutionizing virtually all areas of molecular biosciences, including functional genomics, genetics, applied biomedical research, and agricultural biotechnology. In plant systems, however, a number of hurdles currently exist that limit this technology from reaching its full potential. For example, significant plant molecular biology expertise and effort is still required to generate functional expression constructs that allow simultaneous editing, and especially transcriptional regulation, of multiple different genomic loci or multiplexing, which is a significant advantage of CRISPR/Cas9 versus other genome-editing systems. To streamline and facilitate rapid and wide-scale use of CRISPR/Cas9-based technologies for plant research, we developed and implemented a comprehensive molecular toolbox for multifaceted CRISPR/Cas9 applications in plants. This toolbox provides researchers with a protocol and reagents to quickly and efficiently assemble functional CRISPR/Cas9 transfer DNA constructs for monocots and dicots using Golden Gate and Gateway cloning methods. It comes with a full suite of capabilities, including multiplexed gene editing and transcriptional activation or repression of plant endogenous genes. We report the functionality and effectiveness of this toolbox in model plants such as tobacco (Nicotiana benthamiana), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), and rice (Oryza sativa), demonstrating its utility for basic and applied plant research.

Abstract The Moon has a magmatic and thermal history that is distinct from that of the terrestrial planets 1 . Radioisotope dating of lunar samples suggests that most lunar basaltic magmatism ceased by around 2.9–2.8 billion years ago (Ga) 2,3 , although younger basalts between 3 Ga and 1 Ga have been suggested by crater-counting chronology, which has large uncertainties owing to the lack of returned samples for calibration 4,5 . Here we report a precise lead–lead age of 2,030 ± 4 million years ago for basalt clasts returned by the Chang’e-5 mission, and a 238 U/ 204 Pb ratio ( µ value) 6 of about 680 for a source that evolved through two stages of differentiation. This is the youngest crystallization age reported so far for lunar basalts by radiometric dating, extending the duration of lunar volcanism by approximately 800–900 million years. The µ value of the Chang’e-5 basalt mantle source is within the range of low-titanium and high-titanium basalts from Apollo sites ( µ value of about 300–1,000), but notably lower than those of potassium, rare-earth elements and phosphorus (KREEP) and high-aluminium basalts 7 ( µ value of about 2,600–3,700), indicating that the Chang’e-5 basalts were produced by melting of a KREEP-poor source. This age provides a pivotal calibration point for crater-counting chronology in the inner Solar System and provides insight on the volcanic and thermal history of the Moon.

Targeting specificity has been a barrier to applying genome editing systems in functional genomics, precise medicine and plant breeding. In plants, only limited studies have used whole-genome sequencing (WGS) to test off-target effects of Cas9. The cause of numerous discovered mutations is still controversial. Furthermore, WGS-based off-target analysis of Cpf1 (Cas12a) has not been reported in any higher organism to date.

CRISPR-Cas12a (formerly Cpf1) is an RNA-guided endonuclease with distinct features that have expanded genome editing capabilities. Cas12a-mediated genome editing is temperature sensitive in plants, but a lack of a comprehensive understanding on Cas12a temperature sensitivity in plant cells has hampered effective application of Cas12a nucleases in plant genome editing. We compared AsCas12a, FnCas12a, and LbCas12a for their editing efficiencies and non-homologous end joining (NHEJ) repair profiles at four different temperatures in rice. We found that AsCas12a is more sensitive to temperature and that it requires a temperature of over 28 °C for high activity. Each Cas12a nuclease exhibited distinct indel mutation profiles which were not affected by temperatures. For the first time, we successfully applied AsCas12a for generating rice mutants with high frequencies up to 93% among T0 lines. We next pursued editing in the dicot model plant Arabidopsis, for which Cas12a-based genome editing has not been previously demonstrated. While LbCas12a barely showed any editing activity at 22 °C, its editing activity was rescued by growing the transgenic plants at 29 °C. With an early high-temperature treatment regime, we successfully achieved germline editing at the two target genes, GL2 and TT4, in Arabidopsis transgenic lines. We then used high-temperature treatment to improve Cas12a-mediated genome editing in maize. By growing LbCas12a T0 maize lines at 28 °C, we obtained Cas12a-edited mutants at frequencies up to 100% in the T1 generation. Finally, we demonstrated DNA binding of Cas12a was not abolished at lower temperatures by using a dCas12a-SRDX-based transcriptional repression system in Arabidopsis. Our study demonstrates the use of high-temperature regimes to achieve high editing efficiencies with Cas12a systems in rice, Arabidopsis, and maize and sheds light on the mechanism of temperature sensitivity for Cas12a in plants.

Abstract The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) systems have been demonstrated to be the foremost compelling genetic tools for manipulating prokaryotic and eukaryotic genomes. Despite the robustness and versatility of Cas9 and Cas12a/b nucleases in mammalian cells and plants, their large protein sizes may hinder downstream applications. Therefore, investigating compact CRISPR nucleases will unlock numerous genome editing and delivery challenges that constrain genetic engineering and crop development. In this study, we assessed the archaeal miniature Un1Cas12f1 type‐V CRISPR nuclease for genome editing in rice and tomato protoplasts. By adopting the reengineered guide RNA modifications ge4.1 and comparing polymerase II (Pol II) and polymerase III (Pol III) promoters, we demonstrated uncultured archaeon Cas12f1 (Un1Cas12f1) genome editing efficacy in rice and tomato protoplasts. We characterized the protospacer adjacent motif (PAM) requirements and mutation profiles of Un1Cas12f1 in both plant species. Interestingly, we found that Pol III promoters, not Pol II promoters, led to higher genome editing efficiency when they were used to drive guide RNA expression. Unlike in mammalian cells, the engineered Un1Cas12f1‐RRA variant did not perform better than the wild‐type Un1Cas12f1 nuclease, suggesting continued protein engineering and other innovative approaches are needed to further improve Un1Cas12f1 genome editing in plants.

Abstract Cytosine base editors (CBEs) and adenine base editors (ABEs) enable precise C-to-T and A-to-G edits. Recently, ABE8e, derived from TadA-8e, enhances A-to-G edits in mammalian cells and plants. Interestingly, TadA-8e can also be evolved to confer C-to-T editing. This study compares engineered CBEs derived from TadA-8e in rice and tomato cells, identifying TadCBEa, TadCBEd, and TadCBEd_V106W as efficient CBEs with high purity and a narrow editing window. A dual base editor, TadDE, promotes simultaneous C-to-T and A-to-G editing. Multiplexed base editing with TadCBEa and TadDE is demonstrated in transgenic rice, with no off-target effects detected by whole genome and transcriptome sequencing, indicating high specificity. Finally, two crop engineering applications using TadDE are shown: introducing herbicide resistance alleles in OsALS and creating synonymous mutations in OsSPL14 to resist OsMIR156 -mediated degradation. Together, this study presents TadA-8e derived CBEs and a dual base editor as valuable additions to the plant editing toolbox.