Programmable nucleases have enabled rapid and accessible genome engineering in eukaryotic cells and living organisms. However, their delivery into target cells can be technically challenging when working with primary cells or in vivo. Here, we use engineered murine leukemia virus-like particles loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins (Nanoblades) to induce efficient genome-editing in cell lines and primary cells including human induced pluripotent stem cells, human hematopoietic stem cells and mouse bone-marrow cells. Transgene-free Nanoblades are also capable of in vivo genome-editing in mouse embryos and in the liver of injected mice. Nanoblades can be complexed with donor DNA for "all-in-one" homology-directed repair or programmed with modified Cas9 variants to mediate transcriptional up-regulation of target genes. Nanoblades preparation process is simple, relatively inexpensive and can be easily implemented in any laboratory equipped for cellular biology.

Abstract Duchenne muscular dystrophy (DMD) affects myofibers and muscle stem cells (SC), causing progressive muscle degeneration and repair defects. It was not known whether dystrophic myoblasts—the effector cells of muscle growth and regeneration—are affected. Using a combination of transcriptomic, molecular, functional analyses, and genome-scale metabolic modelling, we demonstrate, for the first time, convergent cell-autonomous abnormalities in primary mouse and human dystrophic myoblasts. In Dmd mdx mouse myoblasts lacking full-length dystrophin transcripts, the expression of 170 other genes was significantly altered. Myod1 (p=2.9e-21) and key muscle genes controlled by MyoD (Myog, Mymk, Mymx, epigenetic regulators, ECM interactors, calcium signalling and fibrosis genes) were significantly downregulated. Gene ontology enrichment analysis indicated significant alterations in genes involved in muscle development and function. These transcriptomic abnormalities translated into functional alterations such as increased proliferation (p=3.0e-3), reduced chemotaxis towards both sera-rich (p=3.8e-2) and cytokine-containing medium (p=1.0e-2), and significantly accelerated differentiation in 3D organotypic cultures. These altered myoblast functions are essential for muscle regeneration. The defects were caused by the loss of expression of full-length dystrophin, as strikingly similar and not exacerbated alterations were also observed in dystrophin-null Dmd mdx-βgeo myoblasts. Corresponding abnormalities were identified in an established dystrophic mouse muscle (SC5) cell line and human DMD primary myoblasts, confirming universal, cross-species and cell-autonomous nature of these defects. The genome-scale metabolic analysis in human DMD myoblasts indicated significant alteration in the rate of glycolysis/gluconeogenesis (log2FC = 4.8), leukotriene metabolism (log2FC = 4.754), mitochondrial beta-oxidation of branched-chain, odd-chain, and di-unsaturated fatty acids (n-6) (log2FC = -1.187, log2FC = -0.8295 and log2FC = -0.655). These results demonstrate the disease continuum: DMD defects in satellite cells cause myoblast dysfunctions affecting muscle regeneration, which is essential to counteract myofiber loss. Contrary to the established belief, our data demonstrate that typical DMD alterations occur in myoblasts, making these cells a novel therapeutic target for the treatment of this lethal disease.

Abstract Programmable nucleases have enabled rapid and accessible genome engineering in eukaryotic cells and living organisms. However, their delivery into target cells can be technically challenging when working with primary cells or in vivo . Using engineered murine leukemia virus-like particles loaded with Cas9/sgRNA ribonucleoproteins (“Nanoblades”), we were able to induce efficient genome-editing in cell lines and primary cells including human induced pluripotent stem cells, human hematopoietic stem cells and mouse bone-marrow cells. Transgene-free Nanoblades were also capable of in vivo genome-editing in mouse embryos and in the liver of injected mice. Nanoblades can be complexed with donor DNA for “all-in-one” homology-directed repair or programmed with modified Cas9 variants to mediate transcriptional up-regulation of target genes. Nanoblades preparation process is simple, relatively inexpensive and can be easily implemented in any laboratory equipped for cellular biology.

Abstract Rhabdomyosarcoma (RMS) is the main form of soft-tissue sarcoma in children and adolescents. For 20 years, and despite international clinical trials, its cure rate has not really improved, and remains stuck at 20% in case of relapse. The definition of new effective therapeutic combinations is hampered by the lack of reliable models, which complicate the transposition of promising results obtained in pre-clinical studies into efficient solutions for young patients. Inter-patient heterogeneity, particularly in the so-called fusion-negative group (FNRMS), adds an additional level of difficulty in optimizing the clinical management of children and adolescents with RMS. Here, we describe an original 3D-organoid model derived from relapsed FNRMS and show that it finely mimics the characteristics of the original tumor, including inter- and intra-tumoral heterogeneity. Moreover, we have established the proof-of-concept of their preclinical potential by re-evaluating the therapeutic opportunities of targeting apoptosis in FNRMS from a streamlined approach based on the exploitation of bulk and single-cell omics data.

Abstract Faecalibacterium prausnitzii is abundant in the healthy human intestinal microbiota, and the absence or scarcity of this bacterium has been linked with inflammatory diseases and metabolic disorders. F. prausnitzii thus shows promise as a next-generation probiotic for use in restoring the balance of the gut microbial flora and, due to its strong anti-inflammatory properties, for the treatment of certain pathological conditions. However, very little information is available about gene function and regulation in this species. Here, we utilized a systems biology approach - weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) – to analyze gene expression in three publicly available RNAseq datasets from F. prausnitzii strain A2-165, all obtained in different laboratory conditions. The co-expression network was then subdivided into 24 co-expression gene modules. A subsequent enrichment analysis revealed that these modules are associated with different kinds of biological processes, such as arginine, histidine, cobalamin, or fatty acid metabolism as well as bacteriophage function, molecular chaperones, stress response, or SOS response. Some genes appeared to be associated with mechanisms of protection against oxidative stress and could be essential for F. prausnitzii ’s adaptation and survival under anaerobic laboratory conditions. Hub and bottleneck genes were identified by analyses of intramodular connectivity and betweenness, respectively; this highlighted the high connectivity of genes located on mobile genetic elements, which could promote the genetic evolution of F. prausnitzii within its ecological niche. This study provides the first exploration of the complex regulatory networks in F. prausnitzii , and all of the “omics” data are available online for exploration through a graphical interface at https://feaprau.omics.ovh/ .

Mutations in the

Duchenne muscular dystrophy (DMD) causes severe disability of children and death of young men, with an incidence of approximately 1/5,000 male births. Symptoms appear in early childhood, with a diagnosis made around 4 years old, a time where the amount of muscle damage is already significant, preventing early therapeutic interventions that could be more efficient at halting disease progression. In the meantime, the precise moment at which disease phenotypes arise - even asymptomatically - is still unknown. Thus, there is a critical need to better define DMD onset as well as its first manifestations, which could help identify early disease biomarkers and novel therapeutic targets. In this study, we have used human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from DMD patients to model skeletal myogenesis, and compared their differentiation dynamics to healthy control cells by a comprehensive multi-omics analysis. Transcriptome and miRnome comparisons combined with protein analyses at 7 time points demonstrate that hiPSC differentiation 1) mimics described DMD phenotypes at the differentiation endpoint; and 2) homogeneously and robustly recapitulates key developmental steps - mesoderm, somite, skeletal muscle - which offers the possibility to explore dystrophin functions and find earlier disease biomarkers. Starting at the somite stage, mitochondrial gene dysregulations escalate during differentiation. We also describe fibrosis as an intrinsic feature of skeletal muscle cells that starts early during myogenesis. In sum, our data strongly argue for an early developmental manifestation of DMD whose onset is triggered before the entry into the skeletal muscle compartment, data leading to a necessary reconsideration of dystrophin functions during muscle development.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Mutations in the DMD gene lead to Duchenne muscular dystrophy, a severe X-linked neuromuscular disorder which manifests itself as young boys acquire motor functions. DMD is diagnosed after 2 to 4 years, but the absence of dystrophin has an impact before symptoms appear in patients, which poses a serious challenge in the optimization of standards of care. In this report, we investigated the early consequences of dystrophin deficiency during skeletal muscle development. We used single-cell transcriptome profiling to characterize the myogenic trajectory of human pluripotent stem cells and showed that DMD cells bifurcate to an alternative branch when they reach the somite stage. Here, dystrophin deficiency was linked to marked dysregulations of cell junction families involved in the cell state transitions characteristic of somitogenesis. Altogether, this work demonstrates that in vitro, dystrophin deficiency has early consequences during myogenic development, which should be considered in future therapeutic strategies for DMD.