Direct evidence for a role of endogenous retinoic acid (RA), the active metabolite of vitamin A in the initial differentiation and meiotic entry of spermatogonia, and thus in the initiation of spermatogenesis is still lacking. RA is synthesized by dedicated enzymes, the retinaldehyde dehydrogenases (RALDH), and binds to and activates nuclear RA receptors (RARA, RARB, and RARG) either within the RA-synthesizing cells or in the neighboring cells. In the present study, we have used a combination of somatic genetic ablations and pharmacological approaches in vivo to show that during the first, prepubertal, spermatogenic cycle ( i ) RALDH-dependent synthesis of RA by Sertoli cells (SC), the supporting cells of the germ cell (GC) lineage, is indispensable to initiate differentiation of A aligned into A1 spermatogonia; ( ii ) RARA in SC mediates the effects of RA, possibly through activating Mafb expression, a gene whose Drosophila homolog is mandatory to GC differentiation; ( iii ) RA synthesized by premeiotic spermatocytes cell autonomously induces meiotic initiation through controlling the RAR-dependent expression of Stra8 . Furthermore, we show that RA of SC origin is no longer necessary for the subsequent spermatogenic cycles but essential to spermiation. Altogether, our data establish that the effects of RA in vivo on spermatogonia differentiation are indirect, via SC, but direct on meiotic initiation in spermatocytes, supporting thereby the notion that, contrary to the situation in the female, RA is necessary to induce meiosis in the male.

Gametes are generated through a specialized cell differentiation process, meiosis which, in most mammals, is initiated in ovaries during fetal life. It is widely admitted that all-trans retinoic acid (ATRA) is the molecular signal triggering meiosis initiation in mouse female germ cells, but a genetic approach in which ATRA synthesis is impaired disputes this proposal. In the present study, we investigated the contribution of endogenous ATRA to meiosis by analyzing fetuses lacking all RARs ubiquitously, obtained through a tamoxifen-inducible cre recombinase-mediated gene targeting approach. Efficient ablation of RAR-coding genes was assessed by the multiple congenital abnormalities displayed by the mutant fetuses. Unexpectedly, their germ cells robustly expressed STRA8, REC8, SYCP1 and SYCP3, showing that RAR are actually dispensable up to the zygotene stage of meiotic prophase I. Thus our study goes against the current model according to which meiosis is triggered by endogenous ATRA in the developing ovary and revives the identification of the meiosis-preventing substance synthesized by CYP26B1 in the fetal testis.

ABSTRACT NR5A1 is an orphan nuclear receptor crucial for gonadal development in mammals. In the mouse testis it is expressed both in Sertoli cells (SC) and Leydig cells (LC). To investigate its role posteriorly to sex determination, we have generated and analysed mice lacking NR5A1 in SC from embryonic day (E) 13.5 onwards ( Nr5a1 SC−/− mutants). Ablation of Nr5a1 impairs the expression of genes characteristic of SC identity (e.g., Sox9, Amh ), makes SC to progressively die from E14.5 by a Trp53 -independent mechanism, and induces disorganization of the testis cords, which, together, yields germ cells (GC) to prematurely enter meiosis and die, instead of becoming quiescent. Single-cell RNA-sequencing experiments revealed that Nr5a1 -deficient SC acquire a pre-granulosa cell-like identity, and profoundly modify the landscape of the adhesion molecules and extracellular matrix they express. We propose therefore that SC lacking NR5A1 transdifferentiate and die by anoikis. Fetal LC do not display major changes in their transcriptome, indicating that SC are not required beyond E14.5 for their emergence or maintenance. In contrast, adult LC were missing in Nr5a1 SC−/− postnatal testes. In addition, adult males display Müllerian duct derivatives (i.e., uterus, vagina), as well as a decreased anogenital distance and a shorter penis that can be explained by loss of AMH production and defective HSD17B1- and HSD17B3-mediated synthesis of testosterone in SC during fetal life. Together, our findings indicate that Nr5a1 expressed in SC after the period of sex determination safeguards SC identity, which maintains proper seminiferous cord organization and prevents GC to enter meiosis.

Coordinated development of muscles, tendons, and their attachment sites ensures emergence of functional musculoskeletal units that are adapted to diverse anatomical demands among different species. How these different tissues are patterned and functionally assembled during embryogenesis is poorly understood. Here, we investigated the morphogenesis of extraocular muscles (EOMs), an evolutionary conserved cranial muscle group that is crucial for the coordinated movement of the eyeballs and for visual acuity. By means of lineage analysis, we redefined the cellular origins of periocular connective tissues interacting with the EOMs, which do not arise exclusively from neural crest mesenchyme as previously thought. Using 3D imaging approaches, we established an integrative blueprint for the EOM functional unit. By doing so, we identified a developmental time window where individual EOMs emerge from a unique muscle anlage and establish insertions in the sclera, which sets these muscles apart from classical muscle-to-bone type of insertions. Further, we demonstrate that the eyeballs are a source of diffusible retinoic acid that allow their targeting by the EOMs in a temporal and dose dependent manner. Using genetically modified mice and inhibitor treatments, we find that endogenous local variations in the concentration of retinoids contribute to the establishment of tendon condensations and attachment sites that precede the initiation of muscle patterning. Collectively, our results highlight how global and site-specific programs are deployed for the assembly of muscle functional units with precise definition of muscle shapes and topographical wiring of their tendon attachments.

Abstract Study question Is all-trans retinoic acid (ATRA) instrumental to male germ cell differentiation in the mouse beyond the A1 spermatogonia cell stage? Summary answer While ATRA is useless to meiosis initiation, it is crucial to allow germ cells progressing beyond the mid-pachytene stage of meiosis. What is known already In mammals, ATRA is instrumental to spermatogenesis. It is synthesized by retinaldehyde dehydrogenases (RALDH), and then it binds to and activates nuclear receptors (RAR) either within the ATRA-synthesizing cells or in the neighboring cells. We established previously that ATRA synthesized by Sertoli cells initiates differentiation of A aligned into A1 spermatogonia during the 1st spermatogenic cycle. A controversy exists as to the requirement of ATRA in meiosis and spermiogenesis initiations. Some authors propose that ATRA is indispensable to both, while others claim that ATRA is useless to meiotic initiation but essential to spermiogenesis. Study design, size, duration In order to determine the role of ATRA in meiosis and spermiogenesis, we have generated mutant mice lacking all retinaldehyde dehydrogenase (RALDH) activities either in Sertoli cells or in the whole seminiferous epithelium (i.e., in both Sertoli and germ cells). We then compared in these two types of mutants the fate of spermatocytes generated during the first wave of spermatogenesis, following A1 spermatogonia differentiation at post-natal day 4. Participants/materials, setting, methods To generate these mutants, transgenic mice in which the Cre recombinase expression is driven by Stra8 or Amh promoters (active in undifferentiated spermatogonia and Sertoli cells, respectively) were crossed with mice bearing loxP-flanked alleles of Raldh1, Raldh2 and Raldh3. The animals bearing the Amh-Cre transgene lack ATRA only in Sertoli cells, while those bearing both the Amh-Cre and Stra8-Cre transgenes lack ATRA in the whole seminiferous epithelium. Main results and the role of chance In mice lacking RALDH in the whole seminiferous epithelium, we show that differentiated spermatogonia initiate meiosis properly, despite the evident lack of ATRA. However, the generated spermatocytes die by apoptosis at the mid-pachytene stage. They display signs of altered meiotic recombination (i.e., increased methylation of histone H3 on lysine 4, increased phosphorylation of histone H2AX variant, increased number of RAD51 foci), without abnormal chromosomal pairing, as assessed by SYCP1 and SYCP3 distributions. In addition, they lose TEX14 expression and inter-cytoplasmic connections, thus forming syncytia. When ATRA is missing in seminiferous epithelium, the Sertoli cells also are affected. They display an altered architecture, a disrupted distribution of connexin 43, and fail to maintain a functional blood-testis barrier. These defects are possibly related to a cell-autonomous, abnormal, increase of SRC kinase phosphorylation. We finally demonstrate that ATRA given at the preleptotene/leptotene stage is able to rescue all of these defects and to allow normal meiotic progression and spermiogenesis. Altogether, these results indicate that ATRA is required during the early step of meiotic prophase I, not to initiate meiosis by inducing STRA8 expression, but to allow proper chromosome recombination, survival of spermatocytes beyond the mid-pachytene stage and maintenance of Sertoli cell functioning. Limitations, reasons for caution These results were obtained using a mouse model and therefore the relevance for human spermatogenesis remains to be demonstrated. Wider implications of the findings Pharmacological studies support a role for ATRA in spermatogenesis in humans. Whether testicular impairment of ATRA synthesis or functioning might be a cause of azoospermia or oligozoospermia remains to be explored in clinical research. According to our study, ATRA emerges as a potential candidate for developing treatments in infertile patients. Trial registration number N.A.