It is more than 50 years since the lysosome was discovered. Since then its hydrolytic machinery, including proteases and other hydrolases, has been fairly well identified and characterized. Among these are the cysteine cathepsins, members of the family of papain-like cysteine proteases. They have unique reactive-site properties and an uneven tissue-specific expression pattern. In living organisms their activity is a delicate balance of expression, targeting, zymogen activation, inhibition by protein inhibitors and degradation. The specificity of their substrate binding sites, small-molecule inhibitor repertoire and crystal structures are providing new tools for research and development. Their unique reactive-site properties have made it possible to confine the targets simply by the use of appropriate reactive groups. The epoxysuccinyls still dominate the field, but now nitriles seem to be the most appropriate "warhead". The view of cysteine cathepsins as lysosomal proteases is changing as there is now clear evidence of their localization in other cellular compartments. Besides being involved in protein turnover, they build an important part of the endosomal antigen presentation. Together with the growing number of non-endosomal roles of cysteine cathepsins is growing also the knowledge of their involvement in diseases such as cancer and rheumatoid arthritis, among others. Finally, cysteine cathepsins are important regulators and signaling molecules of an unimaginable number of biological processes. The current challenge is to identify their endogenous substrates, in order to gain an insight into the mechanisms of substrate degradation and processing. In this review, some of the remarkable advances that have taken place in the past decade are presented. This article is part of a Special Issue entitled: Proteolysis 50 years after the discovery of lysosome.

We investigated the mechanism of lysosome-mediated cell death using purified recombinant pro-apoptotic proteins, and cell-free extracts from the human neuronal progenitor cell line NT2. Potential effectors were either isolated lysosomes or purified lysosomal proteases. Purified lysosomal cathepsins B, H, K, L, S, and X or an extract of mouse lysosomes did not directly activate either recombinant caspase zymogens or caspase zymogens present in an NT2 cytosolic extract to any significant extent. In contrast, a cathepsin L-related protease from the protozoan parasiteTrypanosoma cruzi, cruzipain, showed a measurable caspase activation rate. This demonstrated that members of the papain family can directly activate caspases but that mammalian lysosomal members of this family may have been negatively selected for caspase activation to prevent inappropriate induction of apoptosis. Given the lack of evidence for a direct role in caspase activation by lysosomal proteases, we hypothesized that an indirect mode of caspase activation may involve the Bcl-2 family member Bid. In support of this, Bid was cleaved in the presence of lysosomal extracts, at a site six residues downstream from that seen for pathways involving capase 8. Incubation of mitochondria with Bid that had been cleaved by lysosomal extracts resulted in cytochrome c release. Thus, cleavage of Bid may represent a mechanism by which proteases that have leaked from the lysosomes can precipitate cytochrome c release and subsequent caspase activation. This is supported by the finding that cytosolic extracts from mice ablated in the bid gene are impaired in the ability to release cytochrome c in response to lysosome extracts. Together these data suggest that Bid represents a sensor that allows cells to initiate apoptosis in response to widespread adventitious proteolysis. We investigated the mechanism of lysosome-mediated cell death using purified recombinant pro-apoptotic proteins, and cell-free extracts from the human neuronal progenitor cell line NT2. Potential effectors were either isolated lysosomes or purified lysosomal proteases. Purified lysosomal cathepsins B, H, K, L, S, and X or an extract of mouse lysosomes did not directly activate either recombinant caspase zymogens or caspase zymogens present in an NT2 cytosolic extract to any significant extent. In contrast, a cathepsin L-related protease from the protozoan parasiteTrypanosoma cruzi, cruzipain, showed a measurable caspase activation rate. This demonstrated that members of the papain family can directly activate caspases but that mammalian lysosomal members of this family may have been negatively selected for caspase activation to prevent inappropriate induction of apoptosis. Given the lack of evidence for a direct role in caspase activation by lysosomal proteases, we hypothesized that an indirect mode of caspase activation may involve the Bcl-2 family member Bid. In support of this, Bid was cleaved in the presence of lysosomal extracts, at a site six residues downstream from that seen for pathways involving capase 8. Incubation of mitochondria with Bid that had been cleaved by lysosomal extracts resulted in cytochrome c release. Thus, cleavage of Bid may represent a mechanism by which proteases that have leaked from the lysosomes can precipitate cytochrome c release and subsequent caspase activation. This is supported by the finding that cytosolic extracts from mice ablated in the bid gene are impaired in the ability to release cytochrome c in response to lysosome extracts. Together these data suggest that Bid represents a sensor that allows cells to initiate apoptosis in response to widespread adventitious proteolysis. acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-p-nitroanilide acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluorometylcoumarin benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amino-4-methylcoumarin benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone trans-epoxysuccinyl-l-leucylamido-4-(4-guanidino) butane dithiothreitol 1,4-piperazinedi-ethanesulfonic acid polyacrylamide gel electrophoresis 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid In mammals, programmed cell death can be initiated by three distinct pathways: (i) the extrinsic pathway, which can be triggered by ligation of death receptors and subsequent caspase 8 activation; (ii) the intrinsic pathway, which is initiated by cellular stress followed by activation of caspase 9; or (iii) the granzyme B pathway, where the cytotoxic cell protease granzyme B is delivered to sensitive target cells. Each of these pathways converges to a common execution phase of apoptosis that requires the activation of caspases 3 and 7 from their inactive zymogen form to their processed, active form (1Salvesen G.S. Dixit V.M. Cell. 1997; 91: 443-446Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1955) Google Scholar, 2Thornberry N.A. Lazebnik Y. Science. 1998; 281: 1312-1316Crossref PubMed Scopus (6221) Google Scholar). The apical activators, caspase 8 and 9, and granzyme B all have a primary specificity for cleavage at Asp297 (caspase 1 numbering convention), located in a region that delineates the large and small subunits of active caspases 3 and 7. The activation of the cell death pathway depends on both the triggering stimulus and the cell type (3Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2651) Google Scholar), and in many forms of apoptosis cytochrome c release from mitochondria is important for activation of downstream caspases (4Green D.R. Reed J.C. Science. 1998; 281: 1309-1312Crossref PubMed Google Scholar). The Bcl-2 protein family contains both pro- and anti-apoptotic members that can act as an upstream checkpoint of caspase activation at the level of the mitochondria by controlling cytochrome c release. Bid, a pro-apoptotic member of the family, has recently been identified as a target for proteolytic cleavage by caspase 8 and granzyme B (5Gross A. Yin X.M. Wang K. Wei M.C. Jockel J. Milliman C. Erdjument-Bromage H. Tempst P. Korsmeyer S.J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 1156-1163Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (933) Google Scholar, 6Li H. Zhu H. Xu C.J. Yuan J. Cell. 1998; 94: 491-501Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3837) Google Scholar, 7Luo X. Budihardjo I. Zou H. Slaughter C. Wang X. Cell. 1998; 94: 481-490Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3110) Google Scholar, 8Yin X.M. Wang K. Gross A. Zhao Y. Zinkel S. Klocke B. Roth K.A. Korsmeyer S.J. Nature. 1999; 400: 886-891Crossref PubMed Scopus (871) Google Scholar). Activated caspase 8 cleaves Bid at Asp59 to trigger translocation from the cytosol to the mitochondria where it promotes cytochrome c release. Direct cleavage of both Bid and the downstream caspases can promote death pathways; however, it is unclear to what degree specificity of cleavage is required. For example, whereas processing of the caspase 3 and 7 zymogens at Asp297 is considered to be the dominant physiologic pathway for activation, cleavage of pro-caspase 7 at Gln295 is sufficient to activate the zymogen in vitro (9Zhou Q. Salvesen G.S. Biochem. J. 1997; 324: 361-364Crossref PubMed Scopus (123) Google Scholar). Such results suggest that alternative proteolytic events may be sufficient to activate pro-caspases and perhaps Bid cleavage, especially in pathologic instances where proteolysis tends to be unregulated. The lysosome is the primary reservoir of nonspecific proteases in the mammalian cell. In certain pathological situations, as well as during normal aging (10Bi X. Yong A.P. Zhou J. Gall C.M. Lynch G. Neuroscience. 2000; 97: 395-404Crossref PubMed Scopus (31) Google Scholar, 11Nakamura Y. Takeda M. Suzuki H. Morita H. Tada K. Hariguchi S. Nishimura T. Neurosci. Lett. 1989; 97: 215-220Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar), lysosomal integrity may be compromised, causing leakage of lysosomal proteases into the cytosol. Thus, certain diseases related to lysosomal pathology may have a primarily apoptotic component. Several lines of evidence support this possibility: (i) leakage of lysosomal proteases into the cytosolic compartment may be involved in the activation of caspases (12Ishisaka R. Utsumi T. Yabuki M. Kanno T. Furuno T. Inoue M. Utsumi K. FEBS Lett. 1998; 435: 233-236Crossref PubMed Scopus (107) Google Scholar); (ii) in Jurkat T-cells, α-tocopheryl succinate triggers apoptosis and caspase 3 activation accompanied by lysosomal destabilization (13Neuzil J. Svensson I. Weber T. Weber C. Brunk U.T. FEBS Lett. 1999; 445: 295-300Crossref PubMed Scopus (118) Google Scholar); and (iii) the lysosomal protease cathepsin B has been implicated in the activation of the proinflammatory caspases 11 (14) and 1 (15Vancompernolle K. Van Herreweghe F. Pynaert G. Van de Craen M. De Vos K. Totty N. Sterling A. Fiers W. Vandenabeele P. Grooten J. FEBS Lett. 1998; 438: 150-158Crossref PubMed Scopus (288) Google Scholar) as well as in the induction of the nuclear morphology associated with apoptotic cells (15Vancompernolle K. Van Herreweghe F. Pynaert G. Van de Craen M. De Vos K. Totty N. Sterling A. Fiers W. Vandenabeele P. Grooten J. FEBS Lett. 1998; 438: 150-158Crossref PubMed Scopus (288) Google Scholar). The role of lysosomal proteases in the activation of the apoptotic pathway is unclear. To examine the possibility that they may be involved in programmed cell death, the activity of both recombinant cathepsins and lysosomal extracts on recombinant caspases and cytosolic extracts was examined. We tested two hypotheses: that lysosomal proteases may directly activate executioner caspases and that lysosomal protease cleavage of Bid may separately trigger the intrinsic apoptosis pathway. Phosphate-buffered saline, fetal bovine serum, cytochrome c, Percoll, EGTA,p-iodonitrotetrazolium violet, penicillin, streptomicin, anti-mouse and anti-rabbit horseradish peroxidase antibodies, and 4-methylumbelliferyl-2-acetamido-2-dexy-β-d-glucopyranoside were purchased from Sigma. All other chemicals were of analytical grade. Human cathepsins B (16Kuhelj R. Dolinar M. Pungercar J. Turk V. Eur. J. Biochem. 1995; 229: 533-539Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar), H (17Popovic T. Brzin J. Kos J. Lenarcic B. Machleidt W. Ritonja A. Hanada K. Turk V. Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1988; 369 (Suppl.): 175-183PubMed Google Scholar), K, (18Linnevers C.J. McGrath M.E. Armstrong R. Mistry F.R. Barnes M.G. Klaus J.L. Palmer J.T. Katz B.A. Bromme D. Protein Sci. 1997; 6: 919-921Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar), L (19Barlic-Maganja D. Dolinar M. Turk V. Biol. Chem. 1998; 379: 1449-1452PubMed Google Scholar) S (20Bromme D. McGrath M.E. Protein Sci. 1996; 5: 789-791Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar), and X (21Klemencic I. Carmona A.K. Cezari M.H. Juliano M.A. Juliano L. Guncar G. Turk D. Krizaj I. Turk V. Turk B. Eur. J. Biochem. 2000; 167: 5404-5412Crossref Scopus (79) Google Scholar), cruzipain (22Stoka V. Nycander M. Lenarcic B. Labriola C. Cazzulo J.J. Bjork I. Turk V. FEBS Lett. 1995; 370: 101-104Crossref PubMed Scopus (87) Google Scholar), and human granzyme B (23Hanna W.L. Zhang X. Turbov J. Winkler U. Hudig D. Froelich C.J. Protein Expres. Purif. 1993; 4: 398-404Crossref PubMed Scopus (67) Google Scholar) were purified as cited. Human stefins A and B (24Jerala R. Kroon-Zitko L. Turk V. Protein Expression Purif. 1994; 5: 65-69Crossref PubMed Scopus (20) Google Scholar) and human cystatins C, D, E/M, and F were purified as described previously (25Abrahamson M. Dalbøge H. Olafsson I. Carlsen S. Grubb A. FEBS Lett. 1988; 236: 14-18Crossref PubMed Scopus (153) Google Scholar, 26Freije J.P. Balbı́n M. Abrahamson M. Velasco G. Dalboge H. Grubb A. López-Otı́n C. J. Biol. Chem. 1993; 268: 15737-15744Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 27Ni J. Fernandez M.A. Danielsson L. Chillakuru R.A. Zhang J. Grubb A. Su J. Gentz R. Abrahamson M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 24797-24804Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (140) Google Scholar, 28Ni J. Abrahamson M. Zhang M. Fernandez M.A. Grubb A. Su J., Yu, G.L. Li Y. Parmelee D. Xing L. Coleman T.A. Gentz S. Thotakura R. Nguyen N. Hesselberg M. Gentz R. J. Biol. Chem. 1997; 272: 10853-10858Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (146) Google Scholar), and human low molecular weight kininogen was purified as described (29Johnson D.A. Salvesen G. Brown M.A. Barrett A.J. Thromb. Res. 1987; 48: 187-193Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (35) Google Scholar). Active caspases 3, 6, 7, 8, and 10 and zymogens of caspases 3 and 7 were expressed and purified from Escherichia coli as described (30Stennicke H.R. Salvesen G.S. Methods. 1999; 17: 313-319Crossref PubMed Scopus (162) Google Scholar). Recombinant mouse Bid was purified as described previously, except that all detergents were omitted from the preparation procedure (31Schendel S.L. Azimov R. Pawlowski K. Godzik A. Kagan B.L. Reed J.C. J. Biol. Chem. 1999; 274: 21932-21936Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (164) Google Scholar). Rabbit antisera against human caspases 3, 6, 7, 8, 9, and 10 were prepared as described (32Krajewski S. Gascoyne R.D. Zapata J.M. Krajewska M. Kitada S. Chhanabhai M. Horsman D. Berean K. Piro L.D. Fugier-Vivier I. Liu Y.J. Wang H.G. Reed J.C. Blood. 1997; 89: 3817-3825Crossref PubMed Google Scholar, 33Stennicke H.R. Deveraux Q.L. Humke E.W. Reed J.C. Dixit V.M. Salvesen G.S. J. Biol. Chem. 1999; 274: 8359-8362Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (423) Google Scholar, 34Stennicke H.R. Jurgensmeier J.M. Shin H. Deveraux Q. Wolf B.B. Yang X. Zhou Q. Ellerby H.M. Ellerby L.M. Bredesen D. Green D.R. Reed J.C. Froelich C.J. Salvesen G.S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 27084-27090Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (650) Google Scholar). Anti-human caspase 2 and monoclonal cytochromec antibody were purchased from Santa Cruz Biotechnology and Pharmingen, respectively. The chromogenic caspase substrate acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA)1 was purchased from BIOMOL, while the fluorogenic substrates benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amino-4-methylcoumarin (Z-FR-AMC), acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluorometylcoumarin (Ac-DEVD-AFC) were obtained from Bachem and Enzyme Systems Products, respectively. The inhibitors E-64 and benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (Z-VAD-fmk) were from Peptide Research Institute and Enzyme Systems Products, respectively. Stock solutions of the substrates and inhibitors were prepared in dimethyl sulfoxide and stored at −20 °C for up to 12 months. Because the purity of lysosomes and mitochondria was paramount in this study, we analyzed all purifications with one mitochondrial and two lysosomal markers to minimize any cross-contamination between these organelles. For lysosomes we followed the activity of lysosomal proteases on Z-FR-AMC substrate (35Barrett A.J. Kirschke H. Methods Enzymol. 1981; 80: 535-561Crossref PubMed Scopus (1789) Google Scholar) and β-hexoaminidase using a method modified from (36Storrie B. Madden E.A. Methods Enzymol. 1990; 182: 203-225Crossref PubMed Scopus (526) Google Scholar). For mitochondria, we used succinicp-iodonitrotetrazolium reductase (37Mehta D.P. Ichikawa M. Salimath P.V. Etchison J.R. Haak R. Manzi A. Freeze H.H. J. Biol. Chem. 1996; 271: 10897-10903Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (39) Google Scholar). Test samples during the purifications were treated with Triton X-100 (final concentration, 1% w/v) and spun at 9,800 × g for 5 min, and the supernatant was assayed. The enzyme assays were carried out at 37 °C. Controls in the absence of the sample were run under the same conditions. A 5-μl sample of each fraction was added to a 96-well plate. The reaction started by addition of 95 μl of prewarmed 10 μm Z-FR-AMC in 100 mm phosphate buffer, pH 6.0, containing 1 mm DTT and 250 mm sucrose. The released product was measured continuously during 5 min at 37 °C using a fmax fluorescence microplate reader (Molecular Devices), at excitation and emission wavelengths of 355 and 460 nm, respectively. For β-hexoaminidase assays, a 25-μl sample was added to a 96-well plate. The reaction was started by addition of 75 μl of 2 mm4-methylumbelliferyl-2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranoside in 400 mm acetate buffer, pH 4.4, containing 250 mm sucrose. The released product was measured continuously during 20 min at 37 °C using the fmax fluorescence microplate reader, at excitation and emission wavelengths of 355 and 460 nm, respectively. A 25-μl sample of succinicp-iodonitrotetrazolium reductase was incubated with 75 μl of 2 mm p-iodonitrotetrazolium violet in 55 mm potassium dihydrogen phosphate and 55 mmsuccinic acid, pH 6.0, containing 250 mm sucrose until a pink color caused by product formation developed. The reaction was stopped by adding 125 μl of 10% trichloroacetic acid, and the pellet was resuspended in 100 μl of ethanol. The sample was clarified at 16,000 × g for 5 min, and the absorbance of the supernatant was read at 495 nm on a SpectraMAX 340 spectrophotometric plate reader (Molecular Devices). Lysosomes were purified from mouse liver as described previously with several modifications (36Storrie B. Madden E.A. Methods Enzymol. 1990; 182: 203-225Crossref PubMed Scopus (526) Google Scholar,38Koenig H. Methods Enzymol. 1974; 31: 457-477Crossref PubMed Scopus (24) Google Scholar). All steps were carried out at 4 °C unless otherwise noted. Briefly, several livers were washed with sucrose/Pipes buffer (250 mm sucrose, 20 mm Pipes, pH 7.2), resuspended in 10 volumes sucrose/Pipes buffer and homogenized by two brief pulses from a Brinkman Polytron homogenizer. The homogenate was centrifuged for 10 min at 540 × g to remove nuclei and particulates. CaCl2 (final concentration, 1 mm) was added to the supernatant, followed by incubation for 5 min at 37 °C to disrupt the mitochondria. The supernatant was centrifuged for 10 min at 18,000 × g, and the heavy membrane pellet was retained. At this point, the integrity of the lysosomes was verified by comparing the activity of the supernatant and the pellet, with the lysosomal protease substrate Z-FR-AMC in the presence and absence of a lysosomotropic detergent (Triton X-100; final concentration, 1% w/v). If the lysosomes were judged at least 80% intact, the heavy membrane fraction was resuspended in sucrose/Pipes buffer, centrifuged again for 10 min at 18,000 × g, and resuspended in Percoll (40% w/v) in sucrose/Pipes. The Percoll solution was centrifuged for 30 min at 44,000 × g to form a gradient, and 1-ml fractions were collected from the bottom of the tube and assayed for mitochondrial contamination using the lysosomal and mitochondrial enzyme markers as described above. The lysosomal fractions were pooled, diluted in sucrose/Pipes (1:10 v/v) to decrease the Percoll, and pelleted by centrifugation at 17,000 ×g for 10 min. The lysosomal pellet was washed, resuspended in an equal volume of sucrose/Pipes, and stored at −70 °C. Soluble lysosomal constituents were released by three freeze-thaw cycles with a 15-s vortex between each cycle. The suspension was centrifuged at 10,000 × g for 10 min to pellet the lysosomal membranes, and the supernatant was saved. Mitochondria were isolated from rat heart according to the procedure described in Ref. 39Goping I.S. Gross A. Lavoie J.N. Nguyen M. Jemmerson R. Roth K. Korsmeyer S.J. Shore G.C. J. Cell Biol. 1998; 143: 207-215Crossref PubMed Scopus (552) Google Scholar. Protein content was determined by Bradford assay (Bio-Rad), and the mitochondria were stored on ice at 3 mg/ml mitochondrial protein. The mitochondria were used within 2 h of preparation. A cytosolic extract from the human neuronal cell line NT2/D1 was prepared as described previously (40Ellerby H.M. Martin S.J. Ellerby L.M. Naiem S.S. Rabizadeh S. Salvesen G.S. Casiano C.A. Cashman N.R. Green D.R. Bredesen D.E. J. Neurosci. 1997; 17: 6165-6178Crossref PubMed Google Scholar). Protein concentration was determined using the Bradford assay (Bio-Rad), and the extract was diluted to 10 mg/ml by the addition of potential caspase activators (cytochrome c or proteases). Samples were resolved by SDS-PAGE on 8–18% gradient acrylamide gels, electrophoretically transferred to Immobilon-P membrane (Millipore), and probed with antibodies against human caspases. Caspase-antibody complexes were detected with horseradish peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG using ECL (Amersham Pharmacia Biotech). The activation of caspase zymogens, whether recombinant or in NT2 cytosolic extracts, was followed fluorometrically by monitoring AFC release from the substrate Ac-DEVD-AFC. A 5-μl aliquot of NT2 cytosolic extract (14 mg/ml) or zymogens of caspases 3 and 7 (70 nm) were incubated in assay buffer (50 mm Hepes, 100 mm NaCl, 0.1% (w/v) CHAPS, 10% (w/v) sucrose, and 10 mm DTT, pH 7.4) with potential proteolytic activators in the range of 1 nmto 1 μm at 37 °C for 30 min, (total volume, 50 μl). For analysis of potential activators in the lysosomal extract, 2–5 μl of extract was used in place of the purified proteases. Activation was analyzed by adding 50 μl of the substrate Ac-DEVD-AFC (200 μm) in 96-well microplate format to a 37 °C thermojacketed fluorescence microplate reader (Molecular Devices), and caspase activity was determined at excitation and emission wavelengths of 405 and 510 nm, respectively. The reaction was followed continuously for 30 min. The steady-state hydrolysis rates were obtained from the linear part of the curves. The instantaneous rates of cruzipain-mediated activation for caspase zymogens 3 and 7 were determined as described previously (9Zhou Q. Salvesen G.S. Biochem. J. 1997; 324: 361-364Crossref PubMed Scopus (123) Google Scholar). Briefly, caspase zymogen 3 (final concentration, 92.3 nm) or caspase zymogen 7 (final concentration, 20 nm) were added to the substrate, the reaction was started by cruzipain addition to final concentrations of 50, 200, or 300 nm, and the time course was followed continuously for 30 min. In separate experiments to characterize the NT2 cytosolic extracts, granzyme B (final concentration, 20 nm) or cytochrome c/dATP (final concentration, 10 μm/1 mm) was added to 40 μl of extract in the presence of Ac-DEVD-pNA (final concentration, 100 μm). Although the NT2 extracts usually activated equally well in the presence or absence of dATP, we kept this in as a standard procedure (41Liu X. Kim C.N. Yang J. Jemmerson R. Wang X. Cell. 1996; 86: 147-157Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4533) Google Scholar), although subsequent descriptions may refer to cytochrome c alone. The release ofp-nitroanilide was continuously recorded during 30 min at 405 nm in 96-well microplate format using a SpectraMAX 340 spectrophotometric plate reader (Molecular Devices) thermojacketed at 37 °C. The active concentration of each of the purified lysosomal proteases was standardized by using E-64 (42Salvesen G. Nagase H. Beynon R.J. Bond J.S. Proteolytic Enzymes: A Practical Approach. IRL Press, Oxford1989: 83-104Google Scholar), and the active concentration of caspases was standardized by a similar protocol utilizing Z-VAD-fmk (30Stennicke H.R. Salvesen G.S. Methods. 1999; 17: 313-319Crossref PubMed Scopus (162) Google Scholar). The endogenous anti-lysosomal protease concentration in NT2 cytosolic extracts was determined by titration using standardized proteases where 5 μl of each enzyme (0.1–2 nm (final concentration) dissolved in 100 mm sodium phosphate, 2 mm DTT, pH 6.0) was incubated with increasing concentrations of NT2 cytosolic extract (0–100 mg/ml) for 30 min at 37 °C. The residual activity in the presence of 10 μm of the lysosomal protease substrate Z-FR-AMC was measured continuously in a thermojacketed fluorescence microplate reader (Molecular Devices) using excitation and emission wavelengths of 355 and 460 nm, respectively. The effects of the cystatins were studied using human stefins A and B (final concentration, 1 μm), cystatins C, D, E, and F (final concentration, 300 nm) and low molecular weight kininogen (2.9 μm) were incubated with caspases 3, 6, 7, and 8 (final concentration, 0.02–10 nm) for 30 min at 37 °C, and the residual activity on Ac-DEVD-AFC (final concentration, 100 μm) was measured as above with excitation and emission wavelengths of 405 and 510 nm, respectively. Protein samples were resolved by SDS-PAGE and transferred to Immobilon-P membrane. The membranes were stained with Coomassie Blue for 2 min, destained, and washed extensively with distilled water. The appropriate bands were excised and sequenced on a 476A protein sequencer (Applied Biosystems). An aliquot of rat mitochondria equal to 10 μg of protein (or 15 μg of protein for mouse mitochondria) incubated in the presence or absence of a 2.5-μl aliquot of Bid at a final concentration of either 1 or 10 nm. Lysosomes at 1 mg/ml protein concentration were added at the indicated volumes. The volume was supplemented to a final volume of 25 μl with cMRM medium (250 mm sucrose, 10 mm Hepes-KOH, 1 mm ATP, 5 mm sodium succinate, 0.08 mm ADP, 2 mmK2HPO4, pH 7.5). The mixtures were incubated at 30 °C for 40 min with gentle shaking. The mitochondria were pelleted by centrifugation for 5 min at 10,000 × g. The resulting pellets were resuspended in 25 μl of 20 mmTris-HCl, pH 8.0, 100 mm NaCl with 5 μl of SDS sample buffer and heated at 100 °C for 5 min. 5 μl of sample buffer was added to the supernatant fractions. The samples were resolved on a 15% Hi-Tris gel (43Fling S.P. Gregerson D.S. Anal. Biochem. 1986; 155: 83-88Crossref PubMed Scopus (837) Google Scholar). The gel was transferred to nitrocellulose (Schleichler & Schuell) and probed with anti-cytochrome c antibody. Antibody complexes were detected with a horseradish peroxidase-conjugated goat-anti mouse IgG (Bio-Rad) using ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Several exposures were taken for each blot. Total cytochrome c content is represented by mitochondrial samples treated with 1% Triton X-100. The procedure is essentially conducted as described previously (5Gross A. Yin X.M. Wang K. Wei M.C. Jockel J. Milliman C. Erdjument-Bromage H. Tempst P. Korsmeyer S.J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 1156-1163Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (933) Google Scholar). Livers of wild type andbid-deficient mice (8Yin X.M. Wang K. Gross A. Zhao Y. Zinkel S. Klocke B. Roth K.A. Korsmeyer S.J. Nature. 1999; 400: 886-891Crossref PubMed Scopus (871) Google Scholar) were homogenized with a Dounce homogenizer in cMRM medium containing 25 μm EGTA, 0.1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 2 mmMgCl2, 2 mm DTT. The homogenates were centrifuged at 1,000 × g for 10 min at 4 °C to remove intact cells and nuclei, and the supernatants were further centrifuged at 10,000 × g at 4 °C for 10 min to precipitate the heavy membrane fractions (mitochondria). The mitochondrial pellet was resuspended in the same buffer. Mitochondria were kept on ice and used within 2 h of preparation. The supernatants were further centrifuged at 100,000 × g for another 60 min to obtain the cytosolic extracts used in the assay. The human NT2/D1 teratocarcinoma cell line, a neuronal progenitor, was chosen for generating cytosolic extracts because it responds well to a variety of apoptotic stimuli (40Ellerby H.M. Martin S.J. Ellerby L.M. Naiem S.S. Rabizadeh S. Salvesen G.S. Casiano C.A. Cashman N.R. Green D.R. Bredesen D.E. J. Neurosci. 1997; 17: 6165-6178Crossref PubMed Google Scholar, 44Gervais F.G. Xu D. Robertson G.S. Vaillancourt J.P. Zhu Y. Huang J. LeBlanc A. Smith D. Rigby M. Shearman M.S. Clarke E.E. Zheng H. Van Der Ploeg L.H. Ruffolo S.C. Thornberry N.A. Xanthoudakis S. Zamboni R.J. Roy S. Nicholson D.W. Cell. 1999; 97: 395-406Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (728) Google Scholar). Caspases 2, 3, 6, 7, 8, 9, and 10, the human caspases currently considered to participate in apoptosis signaling, are present in the cytosolic extract (Fig.1 A). We were able to determine some of the caspase concentrations in the cytosolic extract by semi-quantitative Western blot analysis, where standard recombinant caspases were compared with the endogenous NT2 amounts (for results see Fig. 1 A). These concentrations, although probably lower than the endogenous cytosolic concentration, support rapid caspase activation following addition of activators in vitro. Caspase activation in extracts was followed after the addition of cytochrome c, which resulted in processing of pro-caspases 2, 3, 6, 7, and 9 to their presumptive active forms, whereas the upstream caspases 8 and 10 were not processed under the same conditions (Fig. 1 A). The lack of pro-caspase 8 or 10 processing is in contrast to previous results with Jurkat T-cell extracts (45Slee E.A. Harte M.T. Kluck R.M. Wolf B.B. Casiano C.A. Newmeyer D.D. Wang H.G. Reed J.C. Nicholson D.W. Alnemri E.S. Green D.R. Martin S.J. J. Cell Biol. 1999; 144: 281-292Crossref PubMed Scopus (1703) Google Scholar) but consistent with the general conclusion that these initiators do not participate in executioner caspase activation by the intrinsic (mitochondrial) pathway. We offer no explanation for the processing of pro-caspase 2, because its function in apoptotic pathways is still debated (46Bergeron L. Perez G.I. Macdonald G. Shi L. Sun Y. Jurisicova A. Varmuza S. Latham K.E. Flaws J.A. Salter J.C. Hara H. Moskowitz M.A. Li E. Greenberg A. Tilly J.L. Yuan J. Genes Dev. 1998; 12: 1304-1314Crossref PubMed Scopus (608) Google Scholar, 47Troy C.M. Rabacchi S.A. Friedman W.J. Frappier T.F. Brown K. Shelanski M.L. J. Neurosci. 2000; 20: 1386-1392Crossref PubMed Google Scholar). Activation was also followed by observing the increase in activity against the substrate Ac-DEVD-pNA (Fig.1 B), which predominantly reflects activation of pro-caspase 3, although other caspases will also contribute to the increase in activity (48Stenn

Increasing evidence suggests that lysosomal proteases are actively involved in apoptosis. Using HeLa cells as the model system, we show that selective lysosome disruption with l-leucyl-l-leucine methyl ester results in apoptosis, characterized by translocation of lysosomal proteases into the cytosol and by the cleavage of a proapoptotic Bcl-2-family member Bid. Apoptosis and Bid cleavage, but not translocation of lysosomal proteases to the cytosol, could be prevented by 15 μml-trans-epoxysuccinyl(OEt)-Leu-3-methylbutylamide, an inhibitor of papain-like cysteine proteases. Incubation of cells with 15 μmN-benzoyloxycarbonyl-VAD-fluoromethyl ketone prevented apoptosis but not Bid cleavage, suggesting that cathepsin-mediated apoptosis in this system is caspase-dependent. In vitro experiments performed at neutral pH showed that papain-like cathepsins B, H, L, S, and K cleave Bid predominantly at Arg65 or Arg71. No Bid cleavage was observed with cathepsins C and X or the aspartic protease cathepsin D. Incubation of full-length Bid treated with cathepsins B, H, L, and S resulted in rapid cytochrome c release from isolated mitochondria. Thus, Bid may be an important mediator of apoptosis induced by lysosomal disruption. Increasing evidence suggests that lysosomal proteases are actively involved in apoptosis. Using HeLa cells as the model system, we show that selective lysosome disruption with l-leucyl-l-leucine methyl ester results in apoptosis, characterized by translocation of lysosomal proteases into the cytosol and by the cleavage of a proapoptotic Bcl-2-family member Bid. Apoptosis and Bid cleavage, but not translocation of lysosomal proteases to the cytosol, could be prevented by 15 μml-trans-epoxysuccinyl(OEt)-Leu-3-methylbutylamide, an inhibitor of papain-like cysteine proteases. Incubation of cells with 15 μmN-benzoyloxycarbonyl-VAD-fluoromethyl ketone prevented apoptosis but not Bid cleavage, suggesting that cathepsin-mediated apoptosis in this system is caspase-dependent. In vitro experiments performed at neutral pH showed that papain-like cathepsins B, H, L, S, and K cleave Bid predominantly at Arg65 or Arg71. No Bid cleavage was observed with cathepsins C and X or the aspartic protease cathepsin D. Incubation of full-length Bid treated with cathepsins B, H, L, and S resulted in rapid cytochrome c release from isolated mitochondria. Thus, Bid may be an important mediator of apoptosis induced by lysosomal disruption. Apoptosis is the major mechanism by which multicellular organisms remove superfluous, infected, damaged, or potentially dangerous cells (1Hengartner M.O. Nature. 2000; 407: 770-776Google Scholar). Caspases, a family of cysteine proteases that reside in an inactive zymogen form in the cytosol of virtually every cell, play a major role in apoptotic execution. Caspase activation, a critical event in apoptosis progression, can be achieved in several ways, including the extrinsic pathway, characterized by death receptor-mediated recruitment and activation of apical caspase-8, and the intrinsic pathway, characterized by assembly of cytosolic (APAF-1) and mitochondrial (cytochrome c) factors with subsequent activation of apical caspase-9 (2Adrain C. Martin S.J. Trends Biochem. Sci. 2001; 26: 390-397Google Scholar). These two pathways converge at the level of activation of executioner caspases-3 and -7 (1Hengartner M.O. Nature. 2000; 407: 770-776Google Scholar). The extrinsic and the intrinsic pathways are connected through Bid, a pro-apoptotic BH3-only Bcl-2 family member. In certain cell types, caspase-8 has been shown to cleave Bid after Asp59, thereby removing the two N-terminal helices and converting Bid from a latent to a strongly proapoptotic molecule, capable of inducing cytochrome c release through the action of Bax or Bak and subsequent activation of caspase-9 (3Borner C. Mol. Immunol. 2003; 39: 615-647Google Scholar). Bid is also cleaved during apoptosis by granzyme B, a serine protease from cytotoxic T lymphocytes (4Heibein J.A. Gopsing I.S. Barry M. Pinkoski M.J. Shore G.C. Green D.R. Bleackley R.C. J. Exp. Med. 2000; 192: 1391-1402Google Scholar, 5Sutton V.R. Davis J.E. Cancilla M. Johnstone R.W. Ruefli A.A. Sedelies K. Browne K.A. Trapani J.A. J. Exp. Med. 2000; 192: 1403-1414Google Scholar); by calpains (6Chen M. Hauping H. Shixing Z. Krajewski S. Reed J.C. Gottlieb R.A. J. Biol. Chem. 2001; 276: 30724-30728Google Scholar, 7Mandic A. Viktorsson K. Strandberg L. Heiden T. Hansson J. Linder S. Shoshan M.C. Mol. Cell. Biol. 2002; 22: 3003-3013Google Scholar, 8Gil-Parrado S. Fernández-Montalván A. Assfalg-Machleidt I. Popp O. Bestvater F. Holloschi A. Knoch T.A. Auerswald E.A. Welsh K. Reed J.C. Fritz H. Fuentes-Prior P. Spiess E. Salvesen G.S. Machleidt W. J. Biol. Chem. 2002; 277: 27217-27226Google Scholar); and by lysosomal proteases (9Stoka V. Turk B. Schendel S.L. Kim T.H. Cirman T. Snipas S.J. Ellerby L.M. Bredesen D. Freeze H. Abrahamson M. Brömme D. Krajewski S. Reed J.C. Yin X.M. Turk V. Salvesen G.S. J. Biol. Chem. 2001; 276: 3149-3157Google Scholar). Although all of the cleavage sites differ from the caspase-8 cleavage site, they map to the same region of Bid, corresponding to a loop between α-helices 2 and 3. In addition to caspases, increasing evidence suggests a role for lysosomal proteases in apoptosis, including clearance of infected cells and various pathologies, such as cancer and neurodegeneration (reviewed in Refs. 10Turk B. Stoka V. Rozman-Pungerčar J. Cirman T. Droga Mazovec. G. Orešić K. Turk V. Biol. Chem. 2002; 383: 1035-1044Google Scholar and 11Leist M. Jäättelä M. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2001; 2: 589-598Google Scholar). Lysosomes contain a number of proteases, among them the aspartic protease cathepsin D and the cysteine protease cathepsin B, which are the most abundant and have most often been reported to be involved in apoptosis induction (12Roberg K. Öllinger K. Am. J. Pathol. 1998; 152: 1151-1156Google Scholar, 13Kågedal K. Zhao M. Svensson I. Brunk U.T. Biochem. J. 2001; 359: 335-343Google Scholar, 14Roberg K. Kågedal K. Öllinger K. Am. J. Pathol. 2002; 161: 89-96Google Scholar, 15Guicciardi M.E. Deussing J. Miyoshi H. Bronk S.F. Svingen P.A. Peters C. Kaufmann S.H. Gores G.J. J. Clin. Invest. 2000; 106: 1127-1137Google Scholar, 16Guicciardi M.E. Miyoshi H. Bronk S.F. Gores G.J. Am. J. Pathol. 2001; 159: 2045-2054Google Scholar, 17Foghsgaard L. Wissing D. Mauch D. Lademann U. Bastholm L. Boes M. Elling F. Leist M. Jäättelä M. J. Cell Biol. 2001; 153: 999-1009Google Scholar). The other abundant lysosomal proteases are the family of papain-like cathepsins related to cathepsin B (cathepsins H, L, K, S, C, X, V, W, F, and O; Refs. 18Turk B. Turk D. Turk V. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1477: 98-111Google Scholar and 19Turk V. Turk B. Turk D. EMBO J. 2001; 20: 4629-4633Google Scholar). During apoptosis induced by sphingosine and lysosomotropic reagents, cathepsins were found to be translocated to cytosol prior to mitochondrial damage and cytochrome c release, thereby inducing apoptosis by mechanisms that have not yet been clarified (reviewed in Refs. 10Turk B. Stoka V. Rozman-Pungerčar J. Cirman T. Droga Mazovec. G. Orešić K. Turk V. Biol. Chem. 2002; 383: 1035-1044Google Scholar and 11Leist M. Jäättelä M. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2001; 2: 589-598Google Scholar). In some of the models, cathepsins have been suggested to act independently of caspases, whereas in other models apoptosis was suggested to be caspase-mediated (reviewed in Refs. 10Turk B. Stoka V. Rozman-Pungerčar J. Cirman T. Droga Mazovec. G. Orešić K. Turk V. Biol. Chem. 2002; 383: 1035-1044Google Scholar and 11Leist M. Jäättelä M. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2001; 2: 589-598Google Scholar). Direct caspase activation by the cathepsins is unlikely because a number of the cathepsins failed to activate proapoptotic caspases-3 and -7 (9Stoka V. Turk B. Schendel S.L. Kim T.H. Cirman T. Snipas S.J. Ellerby L.M. Bredesen D. Freeze H. Abrahamson M. Brömme D. Krajewski S. Reed J.C. Yin X.M. Turk V. Salvesen G.S. J. Biol. Chem. 2001; 276: 3149-3157Google Scholar, 20Schotte P. Van Criekinge W. Van de Craen M. Van Loo G. Desmedt M. Grooten J. Cornelissen M. De Ridder L. Vandekerckhove J. Fiers W. Vandenabeele P. Beyaert R. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998; 251: 379-387Google Scholar). Therefore, additional cytosolic factor(s) were suggested to be involved (15Guicciardi M.E. Deussing J. Miyoshi H. Bronk S.F. Svingen P.A. Peters C. Kaufmann S.H. Gores G.J. J. Clin. Invest. 2000; 106: 1127-1137Google Scholar). One of the most attractive cytosolic targets of the cathepsins is Bid, which has already been suggested to be an important mediator of lysosomal protease-mediated apoptosis (9Stoka V. Turk B. Schendel S.L. Kim T.H. Cirman T. Snipas S.J. Ellerby L.M. Bredesen D. Freeze H. Abrahamson M. Brömme D. Krajewski S. Reed J.C. Yin X.M. Turk V. Salvesen G.S. J. Biol. Chem. 2001; 276: 3149-3157Google Scholar, 21Reiners Jr., J.J. Caruso J.A. Mathieu P. Chelladurai B. Yin X.-M. Kessel D. Cell Death Differ. 2002; 9: 934-944Google Scholar). However, the lysosomal protease(s) performing the cleavage have yet to be identified. Our studies were therefore aimed toward understanding the molecular mechanisms by which lysosomal proteases induce apoptosis with the major focus on Bid. Using the lysosomotropic agent LeuLeuOMe, 1The abbreviations used are: LeuLeuOMel-leucyl-l-leucine methyl esterAC27Pacetyl-calpastatin 27-peptideE-64l-trans-epoxysuccinyl-Leu-amido-(4-guanidino) butaneE-64dl-trans-epoxysuccinyl(OEt)-Leu-3-methylbutylamideZN-benzoyloxycarbonylfmkfluoromethyl ketonePARPpoly(ADP-ribose) polymeraseCHAPS3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamino]-1-propanesulphonate.1The abbreviations used are: LeuLeuOMel-leucyl-l-leucine methyl esterAC27Pacetyl-calpastatin 27-peptideE-64l-trans-epoxysuccinyl-Leu-amido-(4-guanidino) butaneE-64dl-trans-epoxysuccinyl(OEt)-Leu-3-methylbutylamideZN-benzoyloxycarbonylfmkfluoromethyl ketonePARPpoly(ADP-ribose) polymeraseCHAPS3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamino]-1-propanesulphonate. we show that disruption of lysosomes results in translocation of lysosomal proteases to the cytosol and induction of apoptosis through a caspase-dependent mechanism, involving Bid cleavage by papain-like cysteine proteases. To identify the cleaving protease(s), a detailed investigation has been performed using cathepsins B, H, L, S, K, X, C, and D. l-leucyl-l-leucine methyl ester acetyl-calpastatin 27-peptide l-trans-epoxysuccinyl-Leu-amido-(4-guanidino) butane l-trans-epoxysuccinyl(OEt)-Leu-3-methylbutylamide N-benzoyloxycarbonyl fluoromethyl ketone poly(ADP-ribose) polymerase 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamino]-1-propanesulphonate. l-leucyl-l-leucine methyl ester acetyl-calpastatin 27-peptide l-trans-epoxysuccinyl-Leu-amido-(4-guanidino) butane l-trans-epoxysuccinyl(OEt)-Leu-3-methylbutylamide N-benzoyloxycarbonyl fluoromethyl ketone poly(ADP-ribose) polymerase 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamino]-1-propanesulphonate. Proteins—Recombinant human cathepsins B, L, and K, human caspase-8, and mouse Bid were prepared according to published procedures (22Kuhelj R. Dolinar M. Pungerčar J. Turk V. Eur. J. Biochem. 1995; 229: 533-539Google Scholar, 23Barlič-Maganja D. Dolinar M. Turk V. Biol. Chem. 1998; 379: 1449-1452Google Scholar, 24D'Alessio K.J. McQueney M.S. Brun K.A. Orsini M.J. Debouck C.M. Protein Expression Purif. 1999; 15: 213-220Google Scholar, 25Stennicke H.R. Salvesen G.S. J. Biol. Chem. 1997; 272: 25719-25722Google Scholar, 26Schendel S.L. Azimov R. Pawlowski K. Godzik A. Kagan B.L. Reed J.C. J. Biol. Chem. 1999; 274: 21932-21936Google Scholar), whereas cathepsins H, X, and C were purified from porcine liver (27Gunčar G. Podobnik M. Pungerčar J. Strukelj B. Turk V. Turk D. Structure. 1998; 6: 51-61Google Scholar), human liver (28Klemenčič I. Karaoglanovic-Carmona A. Juliano M.A. Juliano L. Gunčar G. Turk D. Krizaj I. Turk V. Turk B. Eur. J. Biochem. 2000; 267: 5404-5412Google Scholar), and human kidney (29Dolenc I. Turk B. Kos J. Turk V. FEBS Lett. 1996; 392: 277-280Google Scholar), respectively. All of the cathepsins were active site-titrated as described elsewhere (30Rozman-Pungerčar J. Kopitar-Jerala N. Bogyo M. Turk D. Vasiljeva O. Stefe I. Vandenabeele P. Brömme D. Puizdar V. Fonovič M. Trstenjak-Prebanda M. Dolenc I. Turk V. Turk B. Cell Death Differ. 2003; 10: 881-888Google Scholar). Materials—Human embryonic kidney cell line 293 and human adenocarcinoma cell line HeLa were purchased from ATCC. Polyclonal anti-Bid and anti-cathepsin L antibodies were prepared using standard protocols. Monoclonal antibodies specifically recognizing the cleaved form of PARP were from Promega, and cytochrome c antibodies were from PharMingen. Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit or rabbit anti-mouse IgG antibodies, fetal calf serum, Percoll, p-iodonitrotetrazolium violet, 4-methylumbelliferyl-2-acetamido-2-dexy-d-glucopyranoside, cytochrome c, E-64, E-64d, and pepstatin A were obtained from Sigma. The caspase substrate acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluorometylcoumarin, the calpain-specific inhibitor AC27P, and the lysosomotropic reagent LeuLeuOMe were purchased from Bachem. All of the nucleotide primers were purchased from MWG Biotech AG. All other chemicals were of analytical grade. Cell Culture and Apoptosis Triggering—HEK 293 and HeLa cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen), supplemented with 10% (v/v) fetal calf serum, streptomycin, and penicillin in 5% CO2 atmosphere at 37 °C. HeLa cells from confluent 10-cm dishes were split in a 1:6 ratio to yield 6 × 106/well of 6-well plates. After 10 h E-64d or Z-VAD-fmk was added to a final concentration of 15 μm, followed by overnight incubation. The next day LeuLeuOMe was added in a negligible volume to a final concentration of 400-500 μm. After 24 h the cells were viewed by light microscopy (Olympus M021, magnification 40) and harvested by trypsinization. In control experiments, Me2SO was added in a volume corresponding to the volume of E-64d. Because E-64 and its derivatives also inhibit calpain (30Rozman-Pungerčar J. Kopitar-Jerala N. Bogyo M. Turk D. Vasiljeva O. Stefe I. Vandenabeele P. Brömme D. Puizdar V. Fonovič M. Trstenjak-Prebanda M. Dolenc I. Turk V. Turk B. Cell Death Differ. 2003; 10: 881-888Google Scholar), an additional experiment was performed using 50 μm specific calpain inhibitor AC27P (8Gil-Parrado S. Fernández-Montalván A. Assfalg-Machleidt I. Popp O. Bestvater F. Holloschi A. Knoch T.A. Auerswald E.A. Welsh K. Reed J.C. Fritz H. Fuentes-Prior P. Spiess E. Salvesen G.S. Machleidt W. J. Biol. Chem. 2002; 277: 27217-27226Google Scholar). Cell Extracts—Initially, the cells were washed twice in ice-cold phosphate-buffered saline. After this step, the procedures for preparing cytosolic or total cell extracts differed. To prepare cytosolic extracts, the cells were washed twice in the isotonic buffer (200 mm mannitol, 70 mm sucrose, 1 mm EGTA, 10 mm HEPES) containing a protease inhibitor mixture including pepstatin A, aprotinin, leupeptin, E-64, and bestatin (Sigma). The cells were homogenized by 20 passages through a 25 G (0.5 × 16) needle. Nuclei and unbroken cells were removed by centrifugation at 500 × g for 5 min, followed by two consecutive centrifugation steps, the first at 10,000 × g for 5 min and the second at 100,000 × g for 1 h. Use of the inhibitors ensured that any unwanted proteolysis, especially the proteolysis by papain-like cathepsins, was prevented during the preparation of the extracts. Total cell extracts were prepared from cells by lysing them in 50 μlof RIPA buffer (50 mm Tris, pH 8.0, 100 mm NaCl, 0.1% (w/v) SDS, 1% (v/v) Nonidet P-40, 0.5% (w/v) deoxycholic acid, 1 mm EDTA). Following 10 min of incubation on ice, insoluble material was removed by centrifugation at 14,000 rpm for 10 min. In both cases, the supernatants were transferred to fresh test tubes and either used immediately or stored at -80 °C. Total protein concentration was determined using the Bradford assay (Bio-Rad). Immunodetections—After treatment, aliquots of cell lysates (80 μg of protein based on the Bradford assay) were resolved by 15% SDS-PAGE. Bid, tBid, cathepsin L, the cleaved form of PARP, and cytochrome c were then determined by Western blotting and development with ECL according to the manufacturer's instructions (Amersham Biosciences). Flow Cytometry—To measure phosphatidylserine exposure, 106 HeLa cells were labeled with annexinV-PE and 7-amino-actinomycin D (BD Biosciences) according to the manufacturer's instructions. The cells were then subjected to fluorescence-activated cell sorter analysis using a FACScalibur flow cytometer (BD Biosciences) and CellQuest software. Measurement of DEVD-ase Activity—Cell lysates (100 μg of protein) were transferred into the 96-well plate and filled to the final volume of 90 μl with the caspase buffer (100 mm HEPES, 200 mm NaCl, 0.2% (w/v) CHAPS, 20% (w/v) sucrose, 2 mm EDTA, 20 mm dithiothreitol, pH 7.0). Following 15 min of incubation at 37 °C, acetyl-DEVD-7-amino-4-trifluorometylcoumarin was added to a final concentration of 100 μm, and DEVD-ase activity was measured continuously in an LS50B fluorimeter with plate reader attachment (PerkinElmer Life Sciences) at excitation and emission wavelengths of 400 and 505 nm, respectively. Isolation of Mouse Liver Lysosomes—Lysosomes were isolated from mouse liver essentially as described previously (9Stoka V. Turk B. Schendel S.L. Kim T.H. Cirman T. Snipas S.J. Ellerby L.M. Bredesen D. Freeze H. Abrahamson M. Brömme D. Krajewski S. Reed J.C. Yin X.M. Turk V. Salvesen G.S. J. Biol. Chem. 2001; 276: 3149-3157Google Scholar). The fractions collected were assayed for mitochondrial and lysosomal contents using p-iodonitrotetrazolium reductase and β-hexosaminidase as markers (31Storrie B. Madden E.A. Methods Enzymol. 1990; 182: 203-225Google Scholar, 32Mehta D.P. Ichikawa M. Salimath P.V. Etchison J.R. Haak R. Manzi A. Freeze H.H. J. Biol. Chem. 1996; 271: 10897-10903Google Scholar), respectively. The fractions containing pure lysosomes were pooled and washed twice in an equal volume of lysosomal buffer (250 mm sucrose, 20 mm HEPES, pH 7.2). The lysosomes were then aliquoted and stored at -80 °C for further use. Lysosomal extracts were prepared from lysosomes by three cycles of freezing and thawing. Pellets containing lysosomal membranes were removed by 5 min of centrifugation at 14,000 rpm. The supernatant was kept on ice and used freshly. In Vitro Cleavage of Bid and Analysis of Cleavage Products—To prevent unwanted inactivation, the enzymes were kept in their normal storage buffers (100 mm phosphate buffer, pH 6.0, for lysosomal extract and cathepsins B and C; 100 mm phosphate buffer, pH 6.8, for cathepsin H; 100 mm phosphate buffer, pH 7.0, for cathepsin S; 50 mm acetate buffer, pH 5.1, for cathepsin X; 340 mm acetate buffer, pH 5.5, for cathepsins L and K; and 340 mm acetate buffer, pH 4.2, for cathepsin D) containing 1 mm EDTA. Cathepsins and lysosomal extracts were then added in a small volume (≤5 μl) to the same buffers with pH raised to pH 7.2, containing 2 mm dithiothreitol (final concentration) and 20 μm Bid to a final volume of 35 μl. As verified in separate experiments, this ensured that the final pH (7.2) remained unchanged. Caspase-8 incubated in caspase buffer (see above) was used as a positive control. Following 1 h of incubation at 37 °C, the reactions were terminated by the addition of 5 μl of 1 m dithiothreitol and SDS-PAGE loading buffer and boiling for 5 min. In another experiment, the lysosomal extracts were pretreated with E-64 (final concentration, 20-300 μm) and/or pepstatin A (500 μm) for 30 min prior to addition of Bid. The reaction products were analyzed by SDS-PAGE on 15% gels, followed by Coomassie Blue staining or, alternatively, transferred to the polyvinylidene difluoride membranes, stained for 1 min with Coomassie Blue (Bio-Rad), destained, and washed overnight with distilled water. The appropriate bands were then excised, and the N-terminal sequences of the Bid cleavage products were determined by Applied Biosystems 492 amino acid sequencer. Isolation of Mouse Heart Mitochondria—Mitochondria were isolated from murine hearts using the modified procedure of Ott et al. (33Ott M. Robertson J.D. Gogvadze V. Zhivotovsky B. Orreius S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002; 599: 1259-1263Google Scholar). The mitochondria were resuspended in an equal volume of MSH buffer (250 mm sucrose, 10 mm HEPES, 2 mm KH2PO4, 5 mm sodium succinate, 10 mm EGTA, 0.1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 4 mm MgCl2), pH 7.5, kept on ice, and used within 30 min to minimize the risk of disruption. In Vitro Assay for Cytochrome c Release from Purified Mitochondria— Recombinant Bid (7 μg) was incubated with cathepsins B, L, H, S, and K (final concentrations, 50 nm to 3 μm) in 5 mm HEPES buffer, pH 7.2, containing 250 mm mannitol, 0.5 mm EGTA, 0.1% (w/v) bovine serum albumin and 5 mm dithiothreitol, in a final volume of 30 μl for 40 min at 37 °C prior to the addition of fresh murine mitochondria (20 μg of protein). Following an additional 5-min incubation at 37 °C, the supernatants were separated from mitochondria by centrifugation at 9000 rpm for 5 min at 4 °C. Cytochrome c was then detected by Western blotting. In a control experiment, a pellet containing mitochondria was treated with 2% (v/v) Triton X-100. Preparation of Bid Variants in pcDNA3—Full-length Bid (flBid) was excised from pGEX4Ti vector using EcoRI and XhoI sites and cloned into the pcDNA3 vector at the same sites. Truncated Bid variants were generated by PCR using primers that bound to flBid DNA. The following primers were used: 5′-AGCGAATTCATGTGGGAGGCAGA-3′ for tBid-Tyr47, 5′-TTGGAATTCATGACAGACGGCAGC-3′ for tBid-Gln57, 5′-ATAGAATTCATGGGCAGCCAGGC-3′ for tBid-Asp59, 5′-TCCGAATTCATGTCCTTCAACC-3′ for tBid-Arg65, and 5′-TCGGAATTCATGATAGAGCCAGA-3′ for tBid-Arg71. The reverse primer was always 5′-CCGCTCGAGTCAGTCCATC-3′. All of the sequences were verified by DNA sequencing using an Abi Prism 310 automated DNA sequencer (PerkinElmer Life Sciences). The fragments were then inserted into pcDNA3 using EcoRI and XhoI sites. To check whether the new constructs generate functional protein, tBid and flBid proteins were expressed in vitro using the Promega TnT-coupled transcription-translation system and radiolabeling with [35S]methionine (Amersham Biosciences). The efficiency of expression was monitored by analyzing the translate by SDS-PAGE and autoradiography. Transfections of Cells with tBid Variants—Transfections of HEK 293 cells were performed in 12-well plates. The cells were transfected with equal amounts of pcDNA3/tBid constructs using LipofectAMINE™ 2000 (Invitrogen) according to the instructions of the manufacturer. pcDNA3 and pcDNA3/flBid were used as negative controls, whereas the pcDNA3/caspase-8 construct was used as a positive control. Transfection efficacy was controlled by cotransfections with EGFP. Characterization of LeuLeuOMe-triggered Cell Death in HeLa Cells—LeuLeuOMe has been shown to induce apoptosis in a variety of cells, including natural killer cells and macrophages, by selective disruption of lysosomes. The compound enters lysosomes by endocytosis. LeuLeuOMe accumulates in lysosomes followed by conversion to its membranolytic form (LeuLeu)n-OMe (n ≥ 3) by the transesterase activity of another lysosomal protease, cathepsin C (dipeptidyl peptidase I) (34Thiele D.L. Lipsky P.E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990; 87: 83-87Google Scholar). Finally, lysosomal membrane integrity is lost, resulting in caspase activation and apoptosis (35Uchimoto T. Nohara H. Kamehara R. Iwamura M. Watanabe N. Kobayashi Y. Apoptosis. 1999; 4: 357-362Google Scholar). Various cells exhibit different sensitivity toward LeuLeuOMe, the most sensitive being the cytotoxic lymphocytes (36Thiele D.L. Lipsky P.E. J. Immunol. 1992; 148: 3950-3957Google Scholar, 37Kobayashi Y. Takasaki A. Kurosaka K. Sakurai Y. Iwamura M. Watanabe N. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 272: 687-690Google Scholar). Because of their reasonably high content of Bid and various cathepsins including cathepsin C, we chose HeLa cells as a cellular model to investigate this process. Initially, LeuLeuOMe in the concentration range 50-1000 μm was tested for its ability to induce cell death. The majority of cells died in an apoptotic manner at LeuLeuOMe concentrations of ≥300 μm with an optimum at 400-500 μm. This is in agreement with previous results on human myeloma tumor cell lines U937, HL60, and THP-1 (200-500 μm; Refs. 35Uchimoto T. Nohara H. Kamehara R. Iwamura M. Watanabe N. Kobayashi Y. Apoptosis. 1999; 4: 357-362Google Scholar and 36Thiele D.L. Lipsky P.E. J. Immunol. 1992; 148: 3950-3957Google Scholar). However, at LeuLeuOMe concentrations ≥750 μm, the cells died with necrotic morphology without any increase in caspase activity (not shown). Therefore, all further experiments were performed at LeuLeuOMe concentrations of 400-500 μm. Treatment of HeLa cells with 500 μm LeuLeuOMe for 24 h resulted in detachment of cells from the culture dishes and major morphological changes, such as considerable cell shrinkage and rounding (Fig. 1A). All of the morphological changes were substantially prevented by pretreatment of cells with a general inhibitor of cysteine cathepsins E-64d at 15 μm or with the pancaspase inhibitor Z-VAD-fmk, also at 15 μm (Fig. 1A), suggesting involvement of both cysteine cathepsins and caspases in the process. In the next step, the cells were tested for the surface exposure of phosphatidylserine, another marker of apoptosis, by flow cytometry. Following LeuLeuOMe treatment 62.5% of cells were apoptotic, which could be prevented by pretreating cells with 15 μm E-64d (11.8% apoptotic cells) or with 15 μm Z-VAD-fmk (16.9% apoptotic cells). In a control experiment 10.8% of cells were apoptotic, similar to the result in the presence of E-64d (11.5%) or Z-VAD-fmk (7.5%) alone, which were used as negative controls (Fig. 1B). Similarly, DEVD-ase activity (a reporter of general caspase activation) was highly elevated in LeuLeuOMe-treated cells (Fig. 1C), in agreement with a major role of caspases in this type of cell death (35Uchimoto T. Nohara H. Kamehara R. Iwamura M. Watanabe N. Kobayashi Y. Apoptosis. 1999; 4: 357-362Google Scholar). Caspase-3 activation was confirmed by immunodetection of cleaved PARP using the antibodies that specifically recognize the caspase-3-generated truncated form of PARP in LeuLeuOMe-treated cells only (Fig. 1D). However, caspase activity could be ablated by pretreating cells either with 15 μm E-64d or 15 μm Z-VAD-fmk (Fig. 1, C and D) but not by AC27P (Fig. 1C), thereby suggesting that calpains are not implicated in this apoptosis model. Finally, translocation of lysosomal proteases to the cytosol was confirmed by Western blot analysis, demonstrating the presence of active cathepsin L in the cytosolic extract of HeLa cells treated with LeuLeuOMe (Fig. 1E). Significantly, none of the inhibitors used (E-64d or Z-VAD-fmk) prevented translocation of cathepsin L to the cytosol, strongly suggesting that active cathepsins are required in the cytosol to activate caspases (Fig. 1E). Interestingly, in all of the control cells but not in LeuLeuOMe-treated cells, a small band with a slightly higher molecular mass (∼33 kDa), probably corresponding to the inactive zymogen form of cathepsin L, was observed (Fig. 1E). LeuLeuOMe-triggered Apoptosis in HeLa Cells Is Accompanied by Bid Cleavage—The finding that cathepsins act upstream of caspases in HeLa cells, where apoptosis was triggered by selective lysosome disruption, raised the question about the molecular mechanism of caspase activation in this model. We focused our studies on Bid, which has been suggested to be a sensor of lysosomal proteases (9Stoka V. Turk B. Schendel S.L. Kim T.H. Cirman T. Snipas S.J. Ellerby L.M. Bredesen D. Freeze H. Abrahamson M. Brömme D. Krajewski S. Reed J.C. Yin X.M. Turk V. Salvesen G.S. J. Biol. Chem. 2001; 276: 3149-3157Google Scholar, 21Reiners Jr., J.J. Caruso J.A. Mathieu P. Chelladurai B. Yin X.-M. Kessel D. Cell Death Differ. 2002; 9: 934-944Google Scholar). First, the presence of Bid in untreated HeLa cells was confirmed, and Bid was found as a full-length form migrating at ∼22 kDa (Fig. 2). Next, HeLa cells were treated for 24 h with LeuLeuOMe (200-400 μm), which resulted in partial cleavage of Bid and appearance of another band migrating at ∼15 kDa. Generation of this truncated (tBid) variant was completely abolished in the presence of E-64d but not Z-VAD-fmk, suggesting that papain-like cathepsins were directly or indirectly responsible for the cleavage. In Vitro Cleavage of Recombinant Bid—Although inhibition of cathepsins blocked Bid cleavage induced by lysosomotropic agents in HeLa cells, this does not necessary indicate that cathepsins directly cleave Bid. To address this question, in vitro experiments were performed using recombinant mouse Bid. First, recombinant Bid was incubated at neutral pH with lysosomal extracts, containing 2.3 μm cathepsins as judged on the basis of E-64 titration, resulting in complete Bid degradation (Fig. 3A). Bid degradation was prevented by preincubation with E-64 (≥15 μm), suggesting that papain-like cathepsins are responsible for the cleavage, in agreement with results in our cellular model. In contrast, preincubation of the extracts with pepstatin (500 μm) only partially protected Bid against degradation, suggesting a minor role, if any, for the cathepsin D and related aspartic proteases. Second, to identify Bid cleavage sites by the lysosomal proteases, the experiment was repeated with a lower concentration of lysosomal extracts (not shown). A single cleavage product was found and analyzed by electroblotting and N-terminal

As a model for defining the role of lysosomal cathepsins in apoptosis, we characterized the action of the lysosomotropic agent LeuLeuOMe using distinct cellular models. LeuLeuOMe induces lysosomal membrane permeabilization, resulting in release of lysosomal cathepsins that cleave the proapoptotic Bcl-2 family member Bid and degrade the antiapoptotic member Bcl-2, Bcl-xL, or Mcl-1. The papain-like cysteine protease inhibitor E-64d largely prevented apoptosis, Bid cleavage, and Bcl-2/Bcl-xL/Mcl-1 degradation. The pancaspase inhibitor N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(OMe)fluoromethyl ketone failed to prevent Bid cleavage and degradation of anti-apoptotic Bcl-2 homologues but substantially decreased cell death, suggesting that cathepsin-mediated apoptosis in these cellular models mostly follows a caspase-dependent pathway. Moreover, in vitro experiments showed that one or more of the cysteine cathepsins B, L, S, K, and H could cleave Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Bak, and BimEL, whereas no Bax cleavage was observed. On the basis of inhibitor studies, we demonstrate that lysosomal disruption triggered by LeuLeuOMe occurs before mitochondrial damage. We propose that degradation of anti-apoptotic Bcl-2 family members by lysosomal cathepsins synergizes with cathepsin-mediated activation of Bid to trigger a mitochondrial pathway to apoptosis. Moreover, XIAP (X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis) was also found to be a target of cysteine cathepsins, suggesting that cathepsins can mediate caspase-dependent apoptosis also downstream of mitochondria.

The activome can be considered as a subset of the proteome that contains enzymes in their catalytically active form and can be interrogated by using probes targeted towards individual specific enzymes. A subset of such enzymes are proteases that are frequently studied with activity-based probes, small inhibitors equipped with a detectable tag, commonly a fluorophore. Due to the spectral overlap of these commonly used fluorophores, simultaneous analysis becomes limited. To overcome this, we developed a series of protease-selective lanthanide-labeled probes compatible with mass cytometry. Using lanthanide-based tags instead of fluorophores gives us the ability to monitor the activity of multiple proteases in parallel. As proof of concept we developed a panel of cathepsin and legumain specific probes and showed that we were able to identify an activome of these proteases in two cell lines and peripheral blood mononuclear cells, providing a framework for the use of mass cytometry for multiplexed enzyme activity detection.