Toxoplasma gondii is an obligate intracellular, protozoan pathogen of rodents and humans. T. gondii's ability to grow within cells and evade cell-autonomous immunity depends on the integrity of the parasitophorous vacuole (PV). Interferon-inducible guanylate binding proteins (GBPs) are central mediators of T. gondii clearance, however, the precise mechanism linking GBP recruitment to the PV and T. gondii restriction is not clear. This knowledge gap is linked to heterogenous GBP-targeting across a population of vacuoles and the lack of tools to selectively purify the intact PV. To identify mediators of parasite clearance associated with GBP2-positive vacuoles, we employed a novel protein discovery tool automated spatially targeted optical micro proteomics (autoSTOMP). This approach identified inducible nitric oxide synthetase (iNOS) enriched at levels similar to the GBPs in infected bone marrow-derived myeloid cells. iNOS expression on myeloid cells was necessary for mice to control T. gondii growth in vivo and survive acute infection. T. gondii infection of IFNγ-primed macrophage was sufficient to robustly induce iNOS expression. iNOS restricted T. gondii infection through nitric oxide synthesis rather than arginine depletion, leading to robust and selective nitration of the PV. Optimal parasite restriction by iNOS and vacuole nitration depended on the chromosome 3 GBPs. Notably, GBP2 recruitment and ruffling of the PV membrane occurred in iNOS knockouts, however, these vacuoles contained dividing parasites. iNOS activity was necessary for the collapse of the intravacuolar network of nanotubular membranes which connects parasites to each other and the host cytosol. Based on these data we conclude reactive nitrogen species generated by iNOS cooperate with the chromosome 3 GBPs to target distinct biology of the PV that are necessary for optimal parasite clearance in murine myeloid cells.

Spatially Targeted Optical Micro Proteomics (STOMP) is a method to study region-specific protein complexity of a biological specimen. STOMP uses a confocal microscope to both visualize structures of interest and to tag the proteins within those structures by a photo-driven crosslinking reaction so that they can be affinity purified and identified by mass spectrometry1. STOMP has the potential to perform discovery proteomics on sub-cellular structures in a wide range of primary cells types and biopsy-scale tissue samples. However, two significant limitations have prevented the broad adoption of this technique by the scientific community. First, STOMP is performed across two software platforms written in different languages, which requires user operation at each field of view. Up to 48 hours of microscope time is necessary to tag sufficient protein (~1 microgram) for mass spectrometry making STOMP prohibitively time and labor-consuming for many researchers. Second, the original STOMP protocol uses a custom photo-crosslinker that limits the accessibility of the technique for some user. To liberate the user, we developed a protocol that automates communication between Zeiss Zen Black imaging software and FIJI image processing software using a customizable code in SikuliX. To fully automate STOMP (autoSTOMP), this protocol includes a tool to make tile array, autofocus and capture images of fields of view across the sample; as well as a method to modify the file that guides photo-tagging so that subsets of the structures of interest can be targeted. To make this protocol broadly accessible, we implemented a commercially available biotin-benzophenone crosslinker as well as a procedure to block endogenous biotin and purify tagged proteins using magnetic streptavidin beads. Here we demonstrate that autoSTOMP can efficiently label, purify and identify proteins that belong to structures measuring 1-2 micrometer in diameter using human foreskin fibroblasts or mouse bone marrow-derived dendritic cells infected with the protozoan parasite Toxoplasma gondii (Tg). The autoSTOMP platform can easily be adapted to address a range of research questions using Zeiss Zen Black microscopy systems and LC-MS protocols that are standard in many institutional research cores.

ABSTRACT Tissue microenvironment properties like blood flow, extracellular matrix or proximity to immune infiltrate are important regulators of cell biology. However, methods to study regional protein expression in context of the native tissue environment are limited. To address this need we have developed a novel approach to visualize, purify and measure proteins in situ using Automated Spatially Targeted Optical Micro Proteomics (AutoSTOMP) 2.0. We previously implemented AutoSTOMP to identify proteins localized to the vacuoles of obligate intracellular microbes at the 1-2 μm scale within infected host cells 1 . Here we report custom codes in SikuliX to specify regions of heterogeneity in a tissue section and then biotin tag and identify proteins belonging to specific cell types or structures within those regions. To enrich biotinylated targets from fixed tissue samples we developed a biochemical protocol compatible with LC-MS. These tools were applied to a) identify inflammatory proteins expressed by CD68 + macrophages in rat cardiac infarcts and b) characterize inflammatory proteins enriched in IgG4 + lesions in esophageal tissue. These data indicate that AutoSTOMP is a flexible approach to determine regional protein expression in situ on a range of primary tissues and clinical biopsies where current tools are limited.