Abstract/Summary Phospholipase C gamma 2 (PLCγ2) plays important roles in cell signaling downstream of various membrane receptors. PLCγ2 contains a multi-domain inhibitory region critical for its regulation, while it has remained unclear how these domains contribute to PLCγ2 activity modulation. Here we determined three structures of human PLCγ2 in autoinhibited states, which reveal dynamic interactions at the autoinhibition interface, involving the conformational flexibility of the SH3 domain in the inhibitory region, and its previously unknown interaction with a C-terminal helical domain in the core region. We also determined a structure of PLCγ2 bound to the kinase domain of fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1), which demonstrates the recognition of FGFR1 by the nSH2 domain in the inhibitory region of PLCγ2. Our results provide new structural insights into PLCγ2 regulation that will facilitate future mechanistic studies to understand the entire activation process.

Chaperone proteins play a critical role in the biogenesis of many nascent polypeptides in vivo. In the periplasm of E. coli this role is partially fulfilled by SurA, which promotes the efficient assembly of unfolded outer membrane proteins (uOMPs) into the bacterial outer membrane, though the mechanism by which SurA interacts with uOMPs is not well understood. Here we identify multiple conformations of SurA in solution, one of which contains a cradle-like groove in which client uOMPs bind. Access to this binding groove by clients is gated by the intrinsic conformational dynamics of SurA. Crosslinking mass spectrometry experiments identify multiple regions of native client uOMPs that bind to SurA, providing insight into the molecular determinants of SurA-uOMP interactions. In contrast to other periplasmic chaperones that encapsulate uOMPs, small angle neutron scattering data demonstrate that SurA binding greatly expands client uOMPs. These data can explain the dual roles of SurA as both a holdase and a foldase. Using an integrative modeling approach that combines crosslinking, mass spectrometry, small angle neutron scattering, and simulation, we propose structural models of SurA in complex with an unfolded protein client. We further find that multiple SurA monomers are able to bind discrete sites on a single uOMP. The structural arrangement of SurA and uOMPs provides the basis for a possible mechanism by which SurA binds and expands clients in a manner that facilitates their folding into the outer membrane.

Abstract Outer membrane protein (OMP) biogenesis in gram-negative bacteria is managed by a network of periplasmic chaperones that includes SurA, Skp, and FkpA. These chaperones bind unfolded OMPs (uOMPs) in dynamic conformational ensembles to suppress uOMP aggregation, facilitate diffusion across the periplasm, and enhance OMP folding. FkpA primarily responds to heat-shock stress, but its mechanism is comparatively understudied. To determine FkpA chaperone function, we monitored the folding of a cognate client uOmpA 171 and found that FkpA increases the folded uOmpA 171 population but also slows the folding rate, dual functions distinct from the other periplasmic chaperones. The results indicate that FkpA behaves as a chaperone and not as a folding catalyst to directly influence the uOmpA 171 folding trajectory. We determine the binding affinity between FkpA and uOmpA 171 by globally fitting sedimentation velocity titrations and found it to be intermediate between the known affinities of Skp and SurA for uOMP clients. Notably, complex formation steeply depends on the urea concentration, suggestive of an extensive binding interface. Initial characterizations of the complex using photo-crosslinking indicates that the binding interface spans the inner surfaces of the entire FkpA molecule. In contrast to prior findings, folding and binding experiments performed using subdomain constructs of FkpA demonstrate that the full-length chaperone is required for full activity. Together these results support that FkpA has a distinct and direct effect on uOMP folding and that it achieves this by utilizing an extensive chaperone-client interface. Significance The periplasmic chaperone network is required for the survival and virulence of gram-negative bacteria. Here we find that the chaperone FkpA enhances outer membrane protein folding and tightly binds its clients with an extensive interaction interface. This modified holdase function of FkpA distinguishes it from other periplasmic chaperones and complements their functions to ensure robust outer membrane biogenesis.