There has never been a wholesale way of identifying neurons that are monosynaptically connected either to some other cell group or, especially, to a single cell. The best available tools, transsynaptic tracers, are unable to distinguish weak direct connections from strong indirect ones. Furthermore, no tracer has proven potent enough to label any connected neurons whatsoever when starting from a single cell. Here we present a transsynaptic tracer that crosses only one synaptic step, unambiguously identifying cells directly presynaptic to the starting population. Based on rabies virus, it is genetically targetable, allows high-level expression of any gene of interest in the synaptically coupled neurons, and robustly labels connections made to single cells. This technology should enable a far more detailed understanding of neural connectivity than has previously been possible.

Human Immunodeficiency Viruses (HIV-1 and HIV-2) rely upon host-encoded proteins to facilitate their replication. Here, we combined genome-wide siRNA analyses with interrogation of human interactome databases to assemble a host-pathogen biochemical network containing 213 confirmed host cellular factors and 11 HIV-1-encoded proteins. Protein complexes that regulate ubiquitin conjugation, proteolysis, DNA-damage response, and RNA splicing were identified as important modulators of early-stage HIV-1 infection. Additionally, over 40 new factors were shown to specifically influence the initiation and/or kinetics of HIV-1 DNA synthesis, including cytoskeletal regulatory proteins, modulators of posttranslational modification, and nucleic acid-binding proteins. Finally, 15 proteins with diverse functional roles, including nuclear transport, prostaglandin synthesis, ubiquitination, and transcription, were found to influence nuclear import or viral DNA integration. Taken together, the multiscale approach described here has uncovered multiprotein virus-host interactions that likely act in concert to facilitate the early steps of HIV-1 infection.

Two genome-wide RNA interference screens published in this issue identify human host factors required for influenza A virus replication in lung epithelia cell lines. König et al. identify 295 host genes required for influenza replication. Of those, 219 are required for efficient wild-type virus growth, and 23 are required for viral entry. Karlas et al. report the discovery of 287 host genes influencing virus replication. An independent assay confirmed 168 hits (59%) inhibiting either the endemic H1N1 (119 hits) or the current pandemic swine-origin (121 hits) influenza A virus strains, with an overlap of 60%. These studies should provide a number of potential targets for host factor-directed antivirals for treatment of influenza viral infection. The small coding capacity of the influenza A virus demands that the virus use the host cellular machinery for many aspects of its life cycle. An integrated systems approach, based on genome-wide RNA interference screening, is now used to identify 295 cellular cofactors required for early-stage influenza virus replication. Knowledge of these host cell requirements provides further targets that could be pursued for antiviral drug development. Influenza A virus is an RNA virus that encodes up to 11 proteins and this small coding capacity demands that the virus use the host cellular machinery for many aspects of its life cycle1. Knowledge of these host cell requirements not only informs us of the molecular pathways exploited by the virus but also provides further targets that could be pursued for antiviral drug development. Here we use an integrative systems approach, based on genome-wide RNA interference screening, to identify 295 cellular cofactors required for early-stage influenza virus replication. Within this group, those involved in kinase-regulated signalling, ubiquitination and phosphatase activity are the most highly enriched, and 181 factors assemble into a highly significant host–pathogen interaction network. Moreover, 219 of the 295 factors were confirmed to be required for efficient wild-type influenza virus growth, and further analysis of a subset of genes showed 23 factors necessary for viral entry, including members of the vacuolar ATPase (vATPase) and COPI-protein families, fibroblast growth factor receptor (FGFR) proteins, and glycogen synthase kinase 3 (GSK3)-β. Furthermore, 10 proteins were confirmed to be involved in post-entry steps of influenza virus replication. These include nuclear import components, proteases, and the calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CaM kinase) IIβ (CAMK2B). Notably, growth of swine-origin H1N1 influenza virus is also dependent on the identified host factors, and we show that small molecule inhibitors of several factors, including vATPase and CAMK2B, antagonize influenza virus replication.

Affinity tagging, mass spectroscopy and a tailor-made scoring system are used to identify 497 high-confidence interactions between human proteins and human immunodeficiency virus proteins. Nevan Krogan and colleagues report a global analysis of human proteins that interact with the 18 proteins expressed by HIV-1. Using affinity tagging and mass spectrometry combined with a new quantitative scoring system and a high level of validation by co-immunoprecipitation, they identify 497 HIV–human protein–protein interactions, providing new insights into host proteins that could play a part in HIV replication. Functional validation of a few of these hits revealed a number of new factors that inhibit HIV replication, including EIF3d, which is cleaved by HIV protease, and DESP and HEAT1, which interact with integrase and inhibit integration. Human immunodeficiency virus (HIV) has a small genome and therefore relies heavily on the host cellular machinery to replicate. Identifying which host proteins and complexes come into physical contact with the viral proteins is crucial for a comprehensive understanding of how HIV rewires the host’s cellular machinery during the course of infection. Here we report the use of affinity tagging and purification mass spectrometry1,2,3 to determine systematically the physical interactions of all 18 HIV-1 proteins and polyproteins with host proteins in two different human cell lines (HEK293 and Jurkat). Using a quantitative scoring system that we call MiST, we identified with high confidence 497 HIV–human protein–protein interactions involving 435 individual human proteins, with ∼40% of the interactions being identified in both cell types. We found that the host proteins hijacked by HIV, especially those found interacting in both cell types, are highly conserved across primates. We uncovered a number of host complexes targeted by viral proteins, including the finding that HIV protease cleaves eIF3d, a subunit of eukaryotic translation initiation factor 3. This host protein is one of eleven identified in this analysis that act to inhibit HIV replication. This data set facilitates a more comprehensive and detailed understanding of how the host machinery is manipulated during the course of HIV infection.

Bacillus anthracis secretes two bipartite toxins thought to be involved in anthrax pathogenesis and resulting death of the host. The current model for intoxication is that protective antigen (PA) toxin subunits bind a single group of cell-surface anthrax toxin receptors (ATRs), encoded by the tumor endothelial marker 8 ( TEM8 ) gene. The ATR/TEM8-PA interaction is mediated by the receptor's extracellular domain related to von Willebrand factor type A or integrin inserted domains (VWA/I domains). A metal ion-dependent adhesion site (MIDAS) located within this domain of the ATR/TEM8 protein chelates a divalent cation critical for PA binding. In this report, we identify a second PA receptor encoded by capillary morphogenesis gene 2 ( CMG2 ), which has 60% amino acid identity to ATR/TEM8 within the VWA/I domain, as well as a conserved MIDAS motif. A recombinant CMG2 protein bound PA and mediated toxin internalization when expressed on receptor-deficient cells. Binding between the CMG2 VWA/I domain and PA was shown to be direct and metal-dependent, although the cation specificity of this interaction is different than that observed with ATR/TEM8. Northern blot analysis revealed that CMG2 is widely expressed in human tissues, indicating that this receptor is likely to be relevant for disease pathogenesis. Finally, a soluble version of the CMG2 VWA/I domain inhibited intoxication of cells expressing endogenous toxin receptors when it was added to PA at a 3:1 ratio. These studies distinguish CMG2 as a second anthrax toxin receptor and identify a potent antitoxin that may prove useful for the treatment of anthrax.

To combat hostile viruses, bacteria and archaea have evolved a unique antiviral defense system composed of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs), together with CRISPR-associated genes (Cas). The CRISPR/Cas9 system develops an adaptive immune resistance to foreign plasmids and viruses by creating site-specific DNA double-stranded breaks (DSBs). Here we adapt the CRISPR/Cas9 system to human cells for intracellular defense against foreign DNA and viruses. Using HIV-1 infection as a model, our results demonstrate that the CRISPR/Cas9 system disrupts latently integrated viral genome and provides long-term adaptive defense against new viral infection, expression and replication in human cells. We show that engineered human-induced pluripotent stem cells stably expressing HIV-targeted CRISPR/Cas9 can be efficiently differentiated into HIV reservoir cell types and maintain their resistance to HIV-1 challenge. These results unveil the potential of the CRISPR/Cas9 system as a new therapeutic strategy against viral infections.

Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii (CRAB) has emerged as a major global pathogen with limited treatment options1. No new antibiotic chemical class with activity against A. baumannii has reached patients in over 50 years1. Here we report the identification and optimization of tethered macrocyclic peptide (MCP) antibiotics with potent antibacterial activity against CRAB. The mechanism of action of this molecule class involves blocking the transport of bacterial lipopolysaccharide from the inner membrane to its destination on the outer membrane, through inhibition of the LptB2FGC complex. A clinical candidate derived from the MCP class, zosurabalpin (RG6006), effectively treats highly drug-resistant contemporary isolates of CRAB both in vitro and in mouse models of infection, overcoming existing antibiotic resistance mechanisms. This chemical class represents a promising treatment paradigm for patients with invasive infections due to CRAB, for whom current treatment options are inadequate, and additionally identifies LptB2FGC as a tractable target for antimicrobial drug development.

Viruses must effectively remodel host cellular pathways to replicate and evade immune defenses, and they must do so with limited genomic coding capacity. Targeting post-translational modification (PTM) pathways provides a mechanism by which viruses can broadly and rapidly transform a hostile host environment into a hospitable one. We used quantitative proteomics to measure changes in two PTM types – phosphorylation and ubiquitination – in response to HIV-1 infection with viruses harboring targeted deletions of a subset of HIV-1 genes. PTM analysis revealed a requirement for Aurora kinase A activity in HIV-1 infection and furthermore revealed that AMP-activated kinase activity is modulated during infection via HIV-1 Vif-mediated degradation of B56-containing protein phosphatase 2A (PP2A). Finally, we demonstrated that the Cullin4A-DDB1-DCAF1 E3 ubiquitin ligase ubiquitinates histone H1 somatic isoforms and that HIV-1 Vpr inhibits this process, leading to defects in DNA repair. Thus, global PTM profiling of infected cells serves as an effective tool for uncovering specific mechanisms of host pathway modulation.