Tremelimumab is a fully human monoclonal antibody that binds to cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) on the surface of activated T lymphocytes. Ablative therapies induce a peripheral immune response which may enhance the effect of anti-CTLA4 treatment in patients with advanced hepatocellular carcinoma (HCC). This study aimed to demonstrate whether tremelimumab could be combined safely and feasibly with ablation.Thirty-two patients with HCC were enrolled: male:female: 28:4; median age: 62 (range 36-76). Patients were given tremelimumab at two dose levels (3.5 and 10mg/kg i.v.) every 4weeks for 6 doses, followed by 3-monthly infusions until off-treatment criteria were met. On day 36, patients underwent subtotal radiofrequency ablation or chemoablation. Staging was performed by contrast-enhanced CT or MRI scan every 8weeks.No dose-limiting toxicities were encountered. The most common toxicity was pruritus. Of the 19 evaluable patients, five (26.3%; 95% CI: 9.1-51.2%) achieved a confirmed partial response. Twelve of 14 patients with quantifiable HCV experienced a marked reduction in viral load. Six-week tumor biopsies showed a clear increase in CD8+ T cells in patients showing a clinical benefit only. Six and 12-month probabilities of tumor progression free survival for this refractory HCC population were 57.1% and 33.1% respectively, with median time to tumor progression of 7.4months (95% CI 4.7 to 19.4months). Median overall survival was 12.3months (95% CI 9.3 to 15.4months).Tremelimumab in combination with tumor ablation is a potential new treatment for patients with advanced HCC, and leads to the accumulation of intratumoral CD8+ T cells. Positive clinical activity was seen, with a possible surrogate reduction in HCV viral load.Studies have shown that the killing of tumors by direct methods (known as ablation) can result in the immune system being activated or switched on. The immune system could potentially also recognize and kill the cancer that is left behind. There are new drugs available known as immune checkpoint inhibitors which could enhance this effect. Here, we test one of these drugs (tremelimumab) together with ablation.ClinicalTrials.gov: NCT01853618.

Intratumoral genomic heterogeneity in glioblastoma (GBM) is a barrier to overcoming therapy resistance, and new strategies that are effective independent of genotype are urgently needed. By correlating intracellular metabolite levels with radiation resistance across dozens of genomically-distinct models of GBM, we found that purine metabolites strongly correlated with radiation resistance. Inhibiting purine, but not pyrimidine, synthesis radiosensitized GBM cells and patient-derived neurospheres by impairing DNA repair in a nucleoside-dependent fashion. Likewise, administration of exogenous purine nucleosides protected sensitive GBM models from radiation by promoting DNA repair. Combining an FDA-approved inhibitor of de novo purine synthesis with radiation arrested growth in GBM xenograft models and depleted intratumoral guanylates. High expression of the rate-limiting enzyme of de novo GTP synthesis was associated with shorter survival in GBM patients. Together, these findings indicate that inhibiting de novo purine synthesis may be a promising strategy to overcome therapy resistance in this genomically heterogeneous disease.

Abstract Background Radiotherapy (RT) is the primary treatment for diffuse midline glioma (DMG), a lethal pediatric malignancy defined by histone H3 lysine 27-to-methionine (H3K27M) mutation. Based on the loss of H3K27 trimethylation producing broad epigenomic alterations, we hypothesized that H3K27M causes a functional double-strand break (DSB) repair defect that could be leveraged therapeutically with PARP inhibitor and RT for selective radiosensitization and antitumor immune responses. Methods H3K27M isogenic DMG cells and orthotopic brainstem DMG tumors in immune deficient and syngeneic, immune competent mice were used to evaluate the efficacy and mechanisms of PARP1/2 inhibition by olaparib or PARP1 inhibition by AZD9574 with concurrent RT. Results H3K27M mutation caused an HRR defect characterized by impaired RT-induced K63-linked polyubiquitination of histone H1 and inhibition of HRR protein recruitment. H3K27M DMG cells were selectively radiosensitized by olaparib in comparison to isogenic controls, and this effect translated to efficacy in H3K27M orthotopic brainstem tumors. Olaparib and RT induced an innate immune response and induction of NK cell (NKG2D) activating ligands leading to increased NK cell-mediated lysis of DMG tumor cells. In immunocompetent syngeneic orthotopic DMG tumors, either olaparib or AZD9574 in combination with RT enhanced intratumoral NK cell infiltration and activity in association with NK cell-mediated therapeutic responses and favorable activity of AZD9574. Conclusions The HRR deficiency in H3K27M DMG can be therapeutically leveraged with PARP inhibitors to radiosensitize and induce an NK cell-mediated antitumor immune response selectively in H3K27M DMG, supporting the clinical investigation of best-in-class PARP inhibitors with RT in DMG patients. Key points H3K27M DMG are HRR defective and selectively radiosensitized by PARP inhibitor. PARP inhibitor with RT enhances NKG2D ligand expression and NK cell-mediated lysis. NK cells are required for the therapeutic efficacy of PARP inhibitor and RT. Importance of the Study Radiotherapy is the cornerstone of H3K27M-mutant diffuse midline glioma treatment, but almost all patients succumb to tumor recurrence with poor overall survival, underscoring the need for RT-based precision combination therapy. Here, we reveal HRR deficiency as an H3K27M-mediated vulnerability and identify a novel mechanism linking impaired RT-induced histone H1 polyubiquitination and the subsequent RNF168/BRCA1/RAD51 recruitment in H3K27M DMG. This model is supported by selective radiosensitization of H3K27M DMG by PARP inhibitor. Notably, the combination treatment results in NKG2D ligand expression that confers susceptibility to NK cell killing in H3K27M DMG. We also show that the novel brain penetrant, PARP1-selective inhibitor AZD9574 compares favorably to olaparib when combined with RT, prolonging survival in a syngeneic orthotopic model of H3K27M DMG. This study highlights the ability of PARP1 inhibition to radiosensitize and induce an NK cell-mediated antitumor immunity in H3K27M DMG and supports future clinical investigation.

Abstract Globally decreased histone 3, lysine 27 tri-methylation (H3K27me3) is a hallmark of H3K27-altered diffuse midline gliomas (DMGs) and group-A posterior fossa ependymomas (PFAs). H3K27-altered DMGs are largely characterized by lysine-to- methionine mutations in histone 3 at position 27 (H3K27M). Most PFAs overexpress EZH inhibitory protein (EZHIP), which possesses a region of similarity to the mutant H3K27M. Both H3K27M and EZHIP inhibit function of the polycomb repressive complex 2 (PRC2) responsible for H3K27me3 deposition. These tumors often arise in neighboring regions of the brainstem and posterior fossa. In rare cases PFAs harbor H3K27M mutations, and DMGs overexpress EZHIP. These findings together raise the possibility that certain cell populations in the developing hindbrain/posterior fossa are especially sensitive to modulation of H3K27me3 states. We identified shared molecular features by comparing genomic, bulk transcriptomic, chromatin-based profiles, and single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data from the two tumor classes. Our approach demonstrated that 1q gain, a key biomarker in PFAs, is prognostic in H3.1K27M, but not H3.3K27M gliomas. Conversely, Activin A Receptor Type 1 (ACVR1), which is associated with mutations in H3.1K27M gliomas, is overexpressed in a subset of PFAs with poor outcome. Despite diffuse H3K27me3 reduction, previous work shows that both tumors maintain genomic H3K27me3 deposition at select sites. We demonstrate heterogeneity in shared patterns of residual H3K27me3 for both tumors that largely segregated with inferred anatomic tumor origins and progenitor populations of tumor cells. In contrast, analysis of genes linked to H3K27 acetylation (H3K27ac)-marked enhancers showed higher expression in astrocytic-like tumor cells. Finally, common H3K27me3-marked genes mapped closely to expression patterns in the human developing hindbrain. Overall, our data demonstrate developmentally relevant molecular similarities between PFAs and H3K27M DMGs and support the overall hypothesis that deregulated mechanisms of hindbrain development are central to the biology of both tumors.

Abstract Recent studies exploring the impact of methylation in tumor evolution suggest that while the methylation status of many of the CpG sites are preserved across distinct lineages, others are altered as the cancer progresses. Since changes in methylation status of a CpG site may be retained in mitosis, they could be used to infer the progression history of a tumor via single-cell lineage tree reconstruction. In this work, we introduce the first principled distance-based computational method, Sgootr , for inferring a tumor’s single-cell methylation lineage tree and jointly identifying lineage-informative CpG sites which harbor changes in methylation status that are retained along the lineage. We apply Sgootr on the single-cell bisulfite-treated whole genome sequencing data of multiregionally-sampled tumor cells from 9 metastatic colorectal cancer patients made available by Bian et al ., as well as multiregionally-sampled single-cell reduced-representation bisulfite sequencing data from a glioblastoma patient made available by Chaligne et al .. We demonstrate that the tumor lineages constructed reveal a simple model underlying colorectal tumor progression and metastatic seeding. A comparison of Sgootr against alternative approaches shows that Sgootr can construct lineage trees with fewer migration events and more in concordance with the sequential-progression model of tumor evolution, in time a fraction of that used in prior studies. Interestingly, lineage-informative CpG sites identified by Sgootr are in inter-CpG island (CGI) regions, as opposed to CGI’s, which have been the main regions of interest in genomic methylation-related analyses. Sgootr is implemented as a Snakemake workflow, available at https://github.com/algo-cancer/Sgootr . Abstract Figure

Abstract Purpose Glioblastoma (GBM) is a lethal disease characterized by inevitable recurrence. Here we investigate the molecular pathways mediating resistance, with the goal of identifying therapeutic opportunities to target this tumor. Experimental Design We developed a longitudinal in vivo recurrence model utilizing patient-derived explants to produce paired specimens (pre- and post-recurrence) following temozolomide(TMZ) and radiation(IR). These specimens were evaluated for treatment response and to identify gene expression pathways driving treatment resistance. Findings were clinically validated using spatial transcriptomics of human GBMs. Results These studies reveal in replicate cohorts, a gene expression profile characterized by upregulation of mesenchymal and stem-like genes at recurrence. Analyses of clinical databases revealed increased expression of this transcriptional profile to be significantly associated with worse median overall survival (248 days vs 430 days, p=0.0004), and upregulation of this profile at recurrence. Most notably, we identified upregulation of TGFβ signaling, and more than one-hundred-fold increase in THY1 levels at recurrence. Utilizing cell sorting, we observed that THY1-positive cells represented <10% of cells in the treatment-naïve tumors and 75-96% in the recurrent tumors. We then isolated THY1-positive cells from treatment-naïve patient samples and determined that they were inherently resistant to chemoradiation in orthotopic models. Additionally, using image-guided biopsies from treatment-naïve human GBM, we conducted spatial transcriptomic analyses. This revealed rare THY1 + regions characterized by mesenchymal/stem-like gene expression, analogous to our recurrent mouse model samples, which co-localized with macrophages within the perivascular niche. Since TGFβ signaling contributes to a mesenchymal/stem-like phenotype, we inhibited TGFβRI activity in vivo which resulted in decreased mesenchymal/stem-like protein levels, including THY1, and restored sensitivity to TMZ/IR in recurrent tumors. Conclusions These findings reveal that GBM recurrence may result from tumor repopulation by pre-existing, therapy-resistant, THY1-positive, mesenchymal/stem-like cells within the perivascular niche. Furthermore, our data demonstrate the promise of targeting upregulated pathways in resistant subclones as a novel mechanism to achieve therapeutic response, and specifically that THY1 expression may represent a biomarker of response to TGFβ inhibition.

Abstract Papillary tumor of the pineal region (PTPR) is an uncommon tumor of the pineal region with distinctive histopathologic and molecular characteristics. Experience is limited with respect to its molecular heterogeneity and clinical characteristics. Here, we describe 39 new cases and combine these with 37 previously published cases for a cohort of 76 PTPR’s, all confirmed by methylation profiling. As previously reported, two main methylation groups were identified (PTPR-A and PTPR-B). In our analysis we extended the subtyping into three subtypes: PTPR-A, PTPR-B1 and PTPR-B2 supported by DNA methylation profile and genomic copy number variations. Frequent loss of chromosome 3 or 14 was found in PTPR-B1 tumors but not in PTPR-B2. Examination of clinical outcome showed that nearly half (14/30, 47%) of examined patients experienced tumor progression with significant difference among the subtypes ( p value = 0.046). Our analysis extends the understanding of this uncommon but distinct neuroepithelial tumor by describing its molecular heterogeneity and clinical outcomes, including its tendency towards tumor recurrence.

Abstract Most TERT promoter (TERTp) clinically relevant sequence variants in CNS tumors are the canonical C228T and C250T mutations. Non-canonical TERTp mutations have been reported mainly in non-CNS tumors. We describe 12 CNS tumors with non-canonical TERTp variants interpreted as clinically relevant. Using clinical targeted NGS panels (2020-2024), we detected c.-100_-79dup (n=2), c.-92_-91insGGCGGCCCCGCCCCTTCCTTTC (n=1), c.-118_-117insTCCCCGGCCCAGCCCCTTCCGGG (n=1), c.-123_-76dup (n=1), c.-110_-89dup (n=2), and c.-57A&gt;C (n=5). Most cases had chromosomal microarray (n=11) and/or methylation array data analyzed using the NCI/Bethesda v.2 classifier (n=9). All non-canonical TERTp variants occurred at a variant allele frequency suggestive of somatic clonal origin (mean, 34%; range, 18-46), and in adults (mean age, 60 years; range, 36-88). Except for the c.-57A&gt;C variant, all non-canonical TERTp variants occurred in tumors with histological and/or molecular diagnostic features of glioblastoma, IDH-wildtype (GBM), often epigenetically aligning to this tumor type. All five tested cases matched to superfamily glioblastoma (score ≥ 0.9), with three to class GBM_RTK_I (&gt;0.9 in 2, 0.86 in 1) and two to GBM_RTK_II (&gt;0.9). The size and sequence of such variants suggest that these may be functionally equivalent to canonical mutations or generate favorable TERTp activation motif conformations like previously reported activating duplications. The c.-57A&gt;C variant is a well-established oncogenic mutation observed in other cancer types but has not been reported in CNS tumors. We describe five cases with the c.-57A&gt;C variant: one GBM matching to methylation class GBM_MES_TYP (0.99); two oligodendroglioma, IDH-mutant and 1p/19q-codeleted, one of which had methylation data matching to class O_IDH (0.99); one diffuse glioma, IDH-mutant, which was partially 1p/19q-codeleted and matched to class O_IDH (0.99); and one anaplastic meningioma, aligning to superfamily meningioma (0.99)/MNG_MAL (0.79). Our findings show that non-canonical TERTp variants typically occur in tumor types that often harbor TERTp canonical mutations, expanding the spectrum of TERTp clinically relevant variants that are molecular biomarkers in CNS tumors.