Metabolite profiling in biomarker discovery, enzyme substrate assignment, drug activity/specificity determination, and basic metabolic research requires new data preprocessing approaches to correlate specific metabolites to their biological origin. Here we introduce an LC/MS-based data analysis approach, XCMS, which incorporates novel nonlinear retention time alignment, matched filtration, peak detection, and peak matching. Without using internal standards, the method dynamically identifies hundreds of endogenous metabolites for use as standards, calculating a nonlinear retention time correction profile for each sample. Following retention time correction, the relative metabolite ion intensities are directly compared to identify changes in specific endogenous metabolites, such as potential biomarkers. The software is demonstrated using data sets from a previously reported enzyme knockout study and a large-scale study of plasma samples. XCMS is freely available under an open-source license at http://metlin.scripps.edu/download/.

Although it has long been recognized that the enteric community of bacteria that inhabit the human distal intestinal track broadly impacts human health, the biochemical details that underlie these effects remain largely undefined. Here, we report a broad MS-based metabolomics study that demonstrates a surprisingly large effect of the gut "microbiome" on mammalian blood metabolites. Plasma extracts from germ-free mice were compared with samples from conventional (conv) animals by using various MS-based methods. Hundreds of features were detected in only 1 sample set, with the majority of these being unique to the conv animals, whereas approximately 10% of all features observed in both sample sets showed significant changes in their relative signal intensity. Amino acid metabolites were particularly affected. For example, the bacterial-mediated production of bioactive indole-containing metabolites derived from tryptophan such as indoxyl sulfate and the antioxidant indole-3-propionic acid (IPA) was impacted. Production of IPA was shown to be completely dependent on the presence of gut microflora and could be established by colonization with the bacterium Clostridium sporogenes. Multiple organic acids containing phenyl groups were also greatly increased in the presence of gut microbes. A broad, drug-like phase II metabolic response of the host to metabolites generated by the microbiome was observed, suggesting that the gut microflora has a direct impact on the drug metabolism capacity of the host. Together, these results suggest a significant interplay between bacterial and mammalian metabolism.

Endogenous metabolites have gained increasing interest over the past 5 years largely for their implications in diagnostic and pharmaceutical biomarker discovery. METLIN (http://metlin.scripps.edu), a freely accessible web-based data repository, has been developed to assist in a broad array of metabolite research and to facilitate metabolite identification through mass analysis. METLIN includes an annotated list of known metabolite structural information that is easily cross-correlated with its catalogue of high-resolution Fourier transform mass spectrometry (FTMS) spectra, tandem mass spectrometry (MS/MS) spectra, and LC/MS data.

Groundbreaking work demonstrated that ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2, and c-Myc, could reprogram murine somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs) (Takahashi and Yamanaka, 2006), and human iPSCs were subsequently generated using similar genetic manipulation (Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007). To address the safety issues arose from harboring integrated exogenous sequences in the target cell genome, a number of modified genetic methods have been developed and produced iPSCs with potentially reduced risks (for discussion, see Yamanaka, 2009, and references therein).

Recently, interest in untargeted metabolomics has become prevalent in the general scientific community among an increasing number of investigators. The majority of these investigators, however, do not have the bioinformatic expertise that has been required to process metabolomic data by using command-line driven software programs. Here we introduce a novel platform to process untargeted metabolomic data that uses an intuitive graphical interface and does not require installation or technical expertise. This platform, called XCMS Online, is a web-based version of the widely used XCMS software that allows users to easily upload and process liquid chromatography/mass spectrometry data with only a few mouse clicks. XCMS Online provides a solution for the complete untargeted metabolomic workflow including feature detection, retention time correction, alignment, annotation, statistical analysis, and data visualization. Results can be browsed online in an interactive, customizable table showing statistics, chromatograms, and putative METLIN identities for each metabolite. Additionally, all results and images can be downloaded as zip files for offline analysis and publication. XCMS Online is available at https://xcmsonline.scripps.edu.

METLIN originated as a database to characterize known metabolites and has since expanded into a technology platform for the identification of known and unknown metabolites and other chemical entities. Through this effort it has become a comprehensive resource containing over 1 million molecules including lipids, amino acids, carbohydrates, toxins, small peptides, and natural products, among other classes. METLIN's high-resolution tandem mass spectrometry (MS/MS) database, which plays a key role in the identification process, has data generated from both reference standards and their labeled stable isotope analogues, facilitated by METLIN-guided analysis of isotope-labeled microorganisms. The MS/MS data, coupled with the fragment similarity search function, expand the tool's capabilities into the identification of unknowns. Fragment similarity search is performed independent of the precursor mass, relying solely on the fragment ions to identify similar structures within the database. Stable isotope data also facilitate characterization by coupling the similarity search output with the isotopic m/ z shifts. Examples of both are demonstrated here with the characterization of four previously unknown metabolites. METLIN also now features in silico MS/MS data, which has been made possible through the creation of algorithms trained on METLIN's MS/MS data from both standards and their isotope analogues. With these informatic and experimental data features, METLIN is being designed to address the characterization of known and unknown molecules.

A molecule isolated from the cerebrospinal fluid of sleep-deprived cats has been chemically characterized and identified as cis-9,10-octadecenoamide. Other fatty acid primary amides in addition to cis-9,10-octadecenoamide were identified as natural constituents of the cerebrospinal fluid of cat, rat, and human, indicating that these compounds compose a distinct family of brain lipids. Synthetic cis-9,10-octadecenoamide induced physiological sleep when injected into rats. Together, these results suggest that fatty acid primary amides may represent a previously unrecognized class of biological signaling molecules.

Metabolites offer an important unexplored complementary approach to understanding the pluripotency of stem cells. Using MS-based metabolomics, we show that embryonic stem cells are characterized by abundant metabolites with highly unsaturated structures whose levels decrease upon differentiation. By monitoring the reduced and oxidized glutathione ratio as well as ascorbic acid levels, we demonstrate that the stem cell redox status is regulated during differentiation. On the basis of the oxidative biochemistry of the unsaturated metabolites, we experimentally manipulated specific pathways in embryonic stem cells while monitoring the effects on differentiation. Inhibition of the eicosanoid signaling pathway promoted pluripotency and maintained levels of unsaturated fatty acids. In contrast, downstream oxidized metabolites (for example, neuroprotectin D1) and substrates of pro-oxidative reactions (for example, acyl-carnitines), promoted neuronal and cardiac differentiation. We postulate that the highly unsaturated metabolome sustained by stem cells allows them to differentiate in response to in vivo oxidative processes such as inflammation.

Metabolism is vital to every aspect of cell function, yet the metabolome of induced pluripotent stem cells (iPSCs) remains largely unexplored. Here we report, using an untargeted metabolomics approach, that human iPSCs share a pluripotent metabolomic signature with embryonic stem cells (ESCs) that is distinct from their parental cells, and that is characterized by changes in metabolites involved in cellular respiration. Examination of cellular bioenergetics corroborated with our metabolomic analysis, and demonstrated that somatic cells convert from an oxidative state to a glycolytic state in pluripotency. Interestingly, the bioenergetics of various somatic cells correlated with their reprogramming efficiencies. We further identified metabolites that differ between iPSCs and ESCs, which revealed novel metabolic pathways that play a critical role in regulating somatic cell reprogramming. Our findings are the first to globally analyze the metabolome of iPSCs, and provide mechanistic insight into a new layer of regulation involved in inducing pluripotency, and in evaluating iPSC and ESC equivalence.