Glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R) activation promotes insulin secretion from pancreatic beta cells, causes weight loss, and is an important pharmacological target in type 2 diabetes (T2D). Like other G protein-coupled receptors, the GLP-1R undergoes agonist-mediated endocytosis, but the functional and therapeutic consequences of modulating GLP-1R endocytic trafficking have not been clearly defined. Here, we investigate a series of biased GLP-1R agonists with variable propensities for GLP-1R internalization and recycling. Compared to a panel of FDA-approved GLP-1 mimetics, compounds that retain GLP-1R at the plasma membrane produce greater long-term insulin release, which is dependent on a reduction in β-arrestin recruitment and faster agonist dissociation rates. Such molecules elicit glycemic benefits in mice without concomitant increases in signs of nausea, a common side effect of GLP-1 therapies. Our study identifies a set of agents with specific GLP-1R trafficking profiles and the potential for greater efficacy and tolerability as T2D treatments.

Background: Atherosclerosis is characterized by lipid deposition, monocyte infiltration and foam cell formation in the artery wall. Translocator protein (TSPO) is abundantly expressed in lipid rich tissues. Recently, TSPO has been identified as a potential diagnostic tool in cardiovascular disease. The purpose of this study was to determine if the TSPO ligand, 18F-PBR111, can identify early atherosclerotic lesions and if TSPO expression can be used to identify distinct macrophage populations during lesion progression. Methods and Results: ApoE-/- mice were maintained on a high-fat diet for 3 or 12 weeks. C57BL/6J mice maintained on chow diet served as controls. Mice were administered 18F-PBR111 intravenously and PET/CT imaged. After euthanasia, aortas were isolated, fixed and optically cleared. Cleared aortas were immunostained with DAPI, and fluorescently labelled with antibodies to-TSPO, the tissue resident macrophage marker F4/80 and the monocyte-derived macrophage marker CD11b. TSPO expression and the macrophage markers were visualised in fatty streaks and mature lesions by light sheet microscopy. While tissue resident F4/80+ macrophages were evident in the arteries of animals without atherosclerosis, no CD11b+ macrophages were observed in these animals. In contrast, mature plaques had high CD11b and low F4/80 expression. A ~3-fold increase in the uptake of 18F-PBR111 was observed in the aortas of atherosclerotic mice relative to controls. Conclusions: Imaging of TSPO expression is a new approach for studying atherosclerotic lesion progression and inflammatory cell infiltration. The TSPO ligand, 18F-PBR111, is a potential clinical diagnostic tool for the detection and quantification of atherosclerotic lesion progression in humans.

Background: Chronic activation of the innate immune system drives inflammation and contributes to atherosclerosis. Pro-inflammatory agents (oxidised LDL, IL-1β) drive lesional inflammation and development, whereas anti-inflammatory agents (IL-10, HDL, Apolipoprotein-AI), promote an anti-inflammatory milieu and resolution. RIPK1 (Receptor interacting protein kinase 1) is a master regulatory gene that decides whether a cell undergoes inflammation, apoptosis and/or necroptosis, depending on its phosphorylation or ubiquitination status. We have previously observed that RIPK1 gene expression is increased in both endothelial cells and macrophages in early atherosclerotic lesions (Karunakaran et al, Circulation 2022). Here, we seek to determine whether macrophage-specific RIPK1 contributes to atherosclerosis. Methods: Given that Ripk1 -/- mice are lethal, we performed bone marrow (BM) transplants of Ripk1 +/- and wild-type (wt) littermate BM into female and male Ldlr -/- mice (n=8-12/grp) and mice were fed a western diet for 12-16 wks. In vitro experiments were performed in BM derived macrophages from wt and Ripk1 +/- mice. Results: Ldlr -/- mice recipient of Ripk1 +/- BM and western diet feeding for 12 or 16 wk had a marked reduction in aortic sinus lesion area (68.9% and 49.7% respectively, p<0.05) compared to their wt controls. Preliminary analysis show that there is a reduction in lesional macrophage area in Ripk1 +/- BM recipient Ldlr -/- mice relative to control (0.02±0.01 vs 0.01±0.006mm, p<0.01), suggesting that macrophage infiltration was reduced. Interestingly, anti-inflammatory agents, including recombinant IL10, IL13 (both 100ng/ml), Apolipoprotein-AI and discoidal HDL (both 500ug/mL) markedly reduced macrophage Ripk1 expression in vitro (by ~50%, p<0.05), likely reducing Ripk1-dependent inflammation and promoting an anti-inflammatory milieu. Current mechanistic studies are investigating the transcriptional regulator, STAT3, as a key regulator of Ripk1 expression. Conclusion: We identified macrophage-RIPK1 as a central driver of atherosclerosis. These timely studies highlight the therapeutic potential of dampening Ripk1 overexpression, as opposed to the detrimental abolishment of Ripk1, in treating atherosclerosis.

Background Previous studies have demonstrated that elevated cholesterol results in increased white blood cell counts in mouse models. However, there is insufficient evidence to support this in humans.Objective To investigate the relationship of plasma lipids with white blood cell counts (basophils, eosinophils, monocytes, neutrophils and lymphocytes) in the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA).Methods The analysis included 2873 MESA participants with a complete white blood count and differential analysis. The cross-sectional association of total cholesterol, LDL cholesterol, HDL cholesterol and triglyceride levels with different white blood cell counts was analyzed by multivariable linear regression.Results After adjusting for sociodemographic and confounding factors including red blood cell counts, platelet counts, use of lipid-lowering medication, CVD risk factors and other lipid measures, and multiple testing correction, a 1-SD increment in total cholesterol and LDL cholesterol was associated with 2.8% and 2.3% lower total white blood cell counts, 3.7% and 3.0% lower monocyte counts, and 3.4% and 2.7% lower neutrophil counts (all p <0.01). The same increment in ln-transformed triglyceride levels was associated with 2.3% higher total white blood cell counts and 4.5% higher lymphocyte counts (both p <0.001). Similar results were obtained after excluding participants taking lipid-lowering medication. A 1-SD increment increase in HDL cholesterol was associated with a 1.5% lower white blood cell count ( p =0.018), but was not significantly associated with changes in any individual cell type.Conclusion Whilst significant associations were observed between plasma lipid levels and white blood cell populations, the heterogenous and modest nature of these relationships make it hard to support the hypothesis that lipids are in the causal pathway for leukogenesis in humans.

Recent advances in tissue clearing and light sheet fluorescence microscopy have improved insights into and understanding of tissue morphology and disease pathology by imaging large samples without the requirement of histological sectioning. However, sample handling and conservation of sample integrity during lengthy staining and acquisition protocols remains a challenge. This study overcomes these challenges with acrylamide hydrogels synthesised to match the refractive index of solutions typically utilised in aqueous tissue clearing protocols. These hydrogels have a high-water content (82.0±3.7% by weight). The gels are stable over time and FITC-IgG readily permeated into, and effluxed out of them. Whilst the gels deformed and/or swelled over time in some commonly used solutions, this was overcome by using a previously described custom RIMS solution. To validate their use, CUBIC cleared mouse tissues and whole embryos were embedded in hydrogels, stained using fluorescent small molecule dyes, labels and antibodies and successfully imaged using light sheet fluorescence microscopy. In conclusion, the high-water content, high refractive index hydrogels described in this study have a broad applicability to research that delves into pathophysiological processes by stabilisating and protecting large and fragile samples.

ABSTRACT Objective: High cholesterol levels in pancreatic β-cells cause oxidative stress and decrease insulin secretion. β-cells can internalize apolipoprotein (apo) A-I, which increases insulin secretion. This study asks whether internalization of apoA-I improves β-cell insulin secretion by reducing oxidative stress. Approach: Ins-1E cells were cholesterol-loaded by incubation with cholesterol-methyl-β-cyclodextrin. Insulin secretion in the presence of 2.8 or 25 mM glucose was quantified by radioimmunoassay. Internalization of fluorescently labelled apoA-I by β-cells was monitored by flow cytometry. The effects of apoA-I internalization on β-cell gene expression was evaluated by RNA sequencing. ApoA-I binding partners on the β-cell surface were identified by mass spectrometry. Mitochondrial oxidative stress was quantified in β-cells and isolated islets with MitoSOX and confocal microscopy. Results: An F 1 -ATPase β-subunit on the β-cell surface was identified as the main apoA-I binding partner. β-cell internalization of apoA-I was time-, concentration-, temperature-, cholesterol- and F 1 -ATPase β-subunit-dependent. β-cells with internalized apoA-I (apoA-I + cells) had higher cholesterol and cell surface F 1 -ATPase β-subunit levels than β-cells without internalized apoA-I (apoA-I − cells). The internalized apoA-I co-localized with mitochondria and was associated with reduced oxidative stress and increased insulin secretion. The ATPase inhibitory factor 1, IF 1 , attenuated apoA-I internalization and increased oxidative stress in Ins-1E β-cells and isolated mouse islets. Differentially expressed genes in apoA-I + and apoA-I − Ins-1E cells were related to protein synthesis, the unfolded protein response, insulin secretion and mitochondrial function. Conclusions: These results establish that β-cells are functionally heterogeneous and apoA-I restores insulin secretion in β-cells with elevated cholesterol levels by improving mitochondrial redox balance.

Abstract The dingo is Australia’s iconic top-order predator and arrived on the continent between 5,000-8,000 years ago. To provide an unbiased insight into its evolutionary affiliations and biological interactions, we coupled long-read DNA sequencing with a multiplatform scaffolding approach to produce an ab initio genome assembly of the desert dingo (85X coverage) we call CanLup_DDS. We compared this genome to the Boxer (CanFam3.1) and German Shepherd dog (CanFam_GSD) assemblies and characterized lineage-specific and shared genetic variation ranging from single– to megabase pair–sized variants. We identified 21,483 dingo-specific and 16,595 domestic dog-specific homozygous structural variants mediating genic and putative regulatory changes. Comparisons between the dingo and domestic dog builds detected unique inversions on Chromosome 16, structural variations in genes linked with starch metabolism, and seven differentially methylated genes. To experimentally assess genomic differences 17 dingoes and 15 German Shepherd dogs were fed parallel diets for 14 days. In dingoes, low AMY2B copy number and serum amylase levels are linked with high cholesterol and LDL levels. Gut microbiome analyses revealed enrichment of the family Clostridiaceae , which can utilize complex resistant starch, while scat metabolome studies identified high phenylethyl alcohol concentrations that we posit are linked with territory marking. Our study provides compelling genomic, microbiome, and metabolomic links showing the dingo has distinct physiology from domestic breed dogs with a unique role in the ecosystem.