An HIV-infected patient in San Francisco with primary syphilis was treated with azithromycin, but the lesion did not resolve. The authors of this case report confirmed resistance to azithromycin and identified a mutation in the 23S rRNA genes of T. pallidum. The mutation was also found in samples collected in Baltimore, Seattle, and Dublin.

ABSTRACT Isolation of Treponema pallidum subsp. pallidum strains still relies on rabbit intratesticular inoculation of clinical samples. Here, we report an alternative isolation approach based on the inoculation of fresh and frozen needle aspirates of primary experimental lesions into culture plates suitable for in vitro propagation of the syphilis agent. SUMMARY We report on a rabbit-free in vitro isolation approach for syphilis strains that can be easily adapted to clinical specimens.

The TprK protein of the syphilis agent, Treponema pallidum subsp. pallidum ( T. pallidum ), undergoes antigenic variation in seven discrete variable (V) regions via non-reciprocal segmental gene conversion. These recombination events transfer information from a repertoire of 53 silent chromosomal donor cassettes (DCs) into the single tprK expression site to continually generate TprK variants. Several lines of research developed over the last two decades support the theory that this mechanism is central to T. pallidum 's ability for immune avoidance and persistence in the host. Structural and modeling data, for example, identify TprK as an integral outer membrane porin with the V regions exposed on the pathogen's surface. Furthermore, infection-induced antibodies preferentially target the V regions rather than the predicted β-barrel scaffolding, and sequence variation abrogates the binding of antibodies elicited by antigenically different V regions. Here, we engineered a T. pallidum strain to impair its ability to vary TprK and assessed its virulence in the rabbit model of syphilis.A suicide vector was transformed into the wild-type (WT) SS14 T. pallidum isolate to eliminate 96% of its tprK DCs. The resulting SS14-DC KO strain exhibited an in vitro growth rate identical to the untransformed strain, supporting that the elimination of the DCs did not affect strain viability in absence of immune pressure. In rabbits injected intradermally with the SS14-DC KO strain, generation of new TprK sequences was impaired, and the animals developed attenuated lesions with a significantly reduced treponemal burden compared to control animals. During infection, clearance of V region variants originally in the inoculum mirrored the generation of antibodies to these variants, although no new variants were generated in the SS14-DC KO strain to overcome immune pressure. Naïve rabbits that received lymph node extracts from animals infected with the SS14-DC KO strain remained uninfected.These data further support the critical role of TprK in T. pallidum virulence and persistence during infection.Syphilis is still endemic in low- and middle-income countries, and it has been resurgent in high-income nations, including the U.S., for years. In endemic areas, there is still significant morbidity and mortality associated with this disease, particularly when its causative agent, the spirochete Treponema pallidum subsp . pallidum ( T. pallidum ) infects the fetus during pregnancy. Improving our understanding of syphilis pathogenesis and T. pallidum biology could help investigators devise better control strategies for this serious infection. Now that tools to genetically manipulate this pathogen are available, we can engineer T. pallidum strains lacking specific genes or genomic regions known (or believed) to be associated with virulence. This approach can shed light on the role of the ablated genes or sequences in disease development using loss-of-function strains. Here, we derived a knockout (KO) T. pallidum mutant (SS14-DC KO ) impaired in its ability to undergo antigenic variation of TprK, a protein that has long been hypothesized to be central in evasion of the host immune response and pathogen persistence during infection. When compared to the WT isolate, which is still capable of antigenic variation, the SS14-DC KO strain is significantly attenuated in its ability to proliferate and to induce early disease manifestations in infected rabbits. Our results further support the importance of TprK antigenic variation in syphilis pathogenesis and pathogen persistence.

Abstract Immune evasion by Treponema pallidum subspecies pallidum ( T. pallidum ) has been attributed to antigenic variation of its putative outer-membrane protein TprK. In TprK, amino acid diversity is confined to seven variable (V) regions, and generation of sequence diversity within the V regions occurs via a non-reciprocal segmental gene conversion mechanism where donor cassettes recombine into the tprK expression site. Although previous studies have shown the significant role of immune selection in driving accumulation of TprK variants, the contribution of baseline gene conversion activity to variant diversity is less clear. Here, combining longitudinal tprK deep sequencing of near clonal Chicago C from immunocompetent and immunosuppressed rabbits along with the newly developed in vitro cultivation system for T. pallidum , we directly characterized TprK alleles in the presence and absence of immune selection. Our data confirm significantly greater sequence diversity over time within the V6 region during syphilis infection in immunocompetent rabbits compared to immunosuppressed rabbits, consistent with previous studies on the role of TprK in evasion of the host immune response. Compared to strains grown in immunocompetent rabbits, strains passaged in vitro displayed low level changes in allele frequencies of TprK variable region sequences similar to that of strains passaged in immunosuppressed rabbits. Notably, we found significantly increased rates of V6 allele generation relative to other variable regions in in vitro cultivated T, pallidum strains, illustrating that the diversity within these hypervariable regions occurs in the complete absence of immune selection. Together, our results demonstrate antigenic variation in T. pallidum can be studied in vitro and occurs even in the complete absence of immune pressure, allowing the T. pallidum population to continuously evade the immune system of the infected host. Author Summary Syphilis continues to be a disease of global and public health concern, even though the infection can be easily diagnosed and effectively treated with penicillin. Although infected individuals often develop a strong immunity to the pathogen, repeated infection with the syphilis agent, Treponema pallidum subspecies pallidum ( T. pallidum ), is possible. Several studies point at antigenic variation of the T. pallidum TprK protein as the mechanism responsible for evasion of the immunity that develops during infection, pathogen persistence, and re-infection. Past studies have highlighted the importance of immune clearance of dominant variants that, in turn, allows less represented variants to emerge. The contribution of an immunity-independent baseline generation of variability in the tprK gene is less clear. Here, we used deep sequencing to profile tprK variants using a laboratory-isolated T. pallidum strain nearly isogenic for tprK that was propagated over time in vitro , where no immune pressure is exerted on the pathogen, as well as in samples obtained from immunosuppressed and immunocompetent rabbits infected with the same strain. We confirmed that tprK accumulates significantly more diversity under immune pressure, and demonstrated a low but discernible basal rate of gene conversion in complete absence of immune pressure.

ABSTRACT Several recent studies have focused on the identification, functional analysis, and structural characterization of outer membrane proteins (OMPs) of Treponema pallidum ( Tp ). The Tp species encompasses the highly related pallidum , pertenue, and endemicum subspecies of this pathogen, known to be the causative agents of syphilis, yaws, and bejel, respectively. These studies highlighted the importance of identifying surface-exposed OMP regions and the identification of B-cell epitopes that could be protective and used in vaccine development efforts. We previously reported that the TprC and TprD OMPs of Tp are predicted to contain external loops scattered throughout the entire length of the proteins, several of which show a low degree of sequence variability among strains and subspecies. In this study, these models were corroborated using AlphaFold2, a state-of-the-art protein structure modeling software. Here, we identified B-cell epitopes across the full-length TprC and TprD variants using the Geysan pepscan mapping approach with antisera from rabbits infected with syphilis, yaws, and bejel strains and from animals immunized with refolded recombinant TprC proteins from three syphilis strains. Our results show that the humoral response is primarily directed to sequences predicted to be on surface-exposed loops of TprC and TprD proteins, and that the magnitude of the humoral response to individual epitopes differs among animals infected with various syphilis strains and Tp subspecies. Rather than exhibiting strain-specificity, antisera showed various degrees of cross-reactivity with variant sequences from other strains. The data support the further exploration of TprC and TprD as vaccine candidates.

ABSTRACT The recently discovered methodologies to cultivate and genetically manipulate Treponema pallidum subsp. pallidum ( T. pallidum ) have significantly helped syphilis research, allowing the in vitro evaluation of antibiotic efficacy, performance of controlled studies to assess differential treponemal gene expression, and generation of loss‐of‐function mutants to evaluate the contribution of specific genetic loci to T. pallidum virulence. Building on this progress, we engineered the T. pallidum SS14 strain to express a red‐shifted green fluorescent protein (GFP) and Sf1Ep cells to express mCherry and blue fluorescent protein (BFP) for enhanced visualization. These new resources improve microscopy‐ and cell sorting–based applications for T. pallidum , better capturing the physical interaction between the host and pathogen, among other possibilities. Continued efforts to develop and share new tools and resources are required to help our overall knowledge of T. pallidum biology and syphilis pathogenesis reach that of other bacterial pathogens, including spirochetes.

SUMMARY The recently discovered methodologies to cultivate and genetically manipulate Treponema pallidum subsp. pallidum ( T. pallidum ) have significantly helped syphilis research, allowing the in vitro evaluation of antibiotic efficacy, performance of controlled studies to assess differential treponemal gene expression, and generation of loss-of-function mutants to evaluate the contribution of specific genetic loci to T. pallidum virulence. Building on this progress, we engineered the T. pallidum SS14 strain to express a red-shifted Green Fluorescent Protein (GFP) and Sf1Ep cells to express mCherry and blue fluorescent protein (BFP) for enhanced visualization. These new resources improve microscopy- and cell sorting-based applications for T. pallidum , better capturing the physical interaction between the host and pathogen, among other possibilities. Continued efforts to develop and share new tools and resources are required to help our overall knowledge of T. pallidum biology and syphilis pathogenesis reach that of other bacterial pathogens, including spirochetes. Graphical abstract By employing genetic engineering, T. pallidum was modified to express GFP, and Sf1Ep cells to express mCherry on the cytoplasmic membrane and BFP in the nucleus. These new resources for syphilis research will facilitate experimental designs to better define the complex interplay between T. pallidum and the host during infection.