Abstract Objective The dysregulation of myeloid-derived cell metabolism can drive atherosclerosis. AMP-activated protein kinase (AMPK) controls various aspects of macrophage dynamics and lipid homeostasis, which are important during atherogenesis. Approach and Results We aimed to clarify the role of myeloid-specific AMPK signaling by using LysM-Cre to drive the deletion of both the α1 and α2 catalytic subunits (MacKO), in male and female mice made acutely atherosclerotic by PCSK9-AAV and Western diet-feeding. After 6 weeks of Western diet feeding, half received daily injection of either the AMPK activator, A-769662 or a vehicle control for a further 6 weeks. After 12 weeks, myeloid cell populations were not different between genotype or sex. Similarly, aortic sinus plaque size, lipid staining and necrotic area were not different in male and female MacKO mice compared to their littermate floxed controls. Moreover, therapeutic intervention with A-769662 had no effect. There were no differences in the amount of circulating total cholesterol or triglyceride, and only minor differences in the levels of inflammatory cytokines between groups. Finally, CD68+ area or markers of autophagy showed no effect of either lacking AMPK signaling or systemic AMPK activation. Conclusions Our data suggest that while defined roles for each catalytic AMPK subunit have been identified, global deletion of myeloid AMPK signaling does not significantly impact atherosclerosis. Moreover, we show that intervention with the first-generation AMPK activator, A-769662, was not able to stem the progression of atherosclerosis. Highlights - The deletion of both catalytic subunits of AMPK in myeloid cells has no significant effect on the progression of atherosclerosis in either male or female mice - Therapeutic delivery of a first-generation AMPK activator (A-769662) for the last 6 weeks of 12-week study had no beneficial effect in either male or female mice - Studying total AMPK deletion may mask specific effects of each isoform and highlights the need for targeted disruption of AMPK phosphorylation sites via knock-in mutations, rather than the traditional “sledgehammer” knockout approach

Abstract Choline is an essential nutrient required for normal neuronal and muscular development, as well as homeostatic regulation of hepatic metabolism. In the liver, choline is incorporated into the main eukaryotic phospholipid, phosphatidylcholine (PC) and can enter one carbon metabolism via mitochondrial oxidation. Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic positive-strand RNA virus that similar to other positive-strand RNA viruses can impact phospholipid metabolism. In the current study we sought to interrogate the link between choline transport and early HCV infection. Namely, we aimed to investigate how HCV modulates markers of choline metabolism following in vitro infection, while subsequently assessing how the inhibition of choline uptake and metabolism upon concurrent HCV infection may alter early viral replication. Finally, we assessed whether these parameters were consistent between cells cultured in fetal bovine serum (FBS) or human serum (HS), conditions known to differentially affect in vitro HCV infection. We observed that choline transport in FBS-cultured Huh7.5 cells is facilitated by the intermediate affinity transporter choline transporter-like family (CTL), and that CTL1 expression and the incorporation of choline into PC is diminished in 24 h infected FBS-cultured cells. Reciprocally, limiting the availability of choline for PC synthesis resulted in increased HCV replication at this early stage. In chronically HS-cultured Huh7.5 cells, there were no differences in the expression of choline transporters upon HCV infection or alterations to viral replication when choline transport was inhibited compared to control treatments. However, inhibiting choline uptake and metabolism in this system significantly impaired the production of infectious virions in HS-cultured cells. These results suggest that in addition to a known role of choline kinase, the transport of choline, potentially via CTL1, might also represent an important and regulated process during HCV infection. Abstract Figure

Background and aims Dysregulated cholesterol metabolism is a hallmark of atherosclerotic cardiovascular diseases, yet our understanding of how endogenous cholesterol synthesis affects atherosclerosis is not clear. The energy sensor AMP-activated protein kinase (AMPK) phosphorylates and inhibits the rate-limiting enzyme in the mevalonate pathway HMG-CoA reductase (HMGCR). Recent work demonstrated that when AMPK-HMGCR signaling was compromised in an Apoe-/- model of hypercholesterolemia, atherosclerosis was exacerbated due to elevated hematopoietic stem and progenitor cell mobilization and myelopoiesis. We sought to validate the significance of the AMPK-HMGCR signaling axis in atherosclerosis using a non-germline hypercholesterolemia model with functional ApoE. Methods Male and female HMGCR S871A knock-in (KI) mice and wild-type (WT) littermate controls were made atherosclerotic by intravenous injection of a gain-of-function Pcsk9D374Y-adeno-associated virus followed by high-fat and high-cholesterol atherogenic western diet feeding for 16 weeks. Results AMPK activation suppressed endogenous cholesterol synthesis in primary bone marrow-derived macrophages from WT but not HMGCR KI mice, without changing other parameters of cholesterol regulation. Atherosclerotic plaque area was unchanged between WT and HMGCR KI mice, independent of sex. Correspondingly, there were no phenotypic differences observed in hematopoietic progenitors or differentiated immune cells in the bone marrow, blood, or spleen, and no significant changes in systemic markers of inflammation. When lethally irradiated female mice were transplanted with KI bone marrow, there was similar plaque content relative to WT. Conclusions Given previous work, our study demonstrates the importance of preclinical atherosclerosis model comparison and brings into question the importance of AMPK-mediated control of cholesterol synthesis in atherosclerosis.

Choline is an essential nutrient that is critical component of the membrane phospholipid phosphatidylcholine (PC), the neurotransmitter acetylcholine and the methylation pathway. In the liver specifically, PC is the major membrane constituent and can be synthesized by the CDP-choline or the phosphatidylethanolamine (PE) N-methyltransferase (PEMT) pathway. With the continuing global rise in the rates of obesity and non-alcoholic fatty liver disease, we sought to explore how excess fatty acids (FA), typical of an obesity and hepatic steatosis, affect choline uptake and metabolism in primary hepatocytes. Our results demonstrate that hepatocytes chronically treated with palmitate, but not oleate or a mixture, had decreased choline uptake, which was associated with lower choline incorporation into PC and lower expression of choline transport proteins. Interestingly, a reduction in the rate of degradation spared PC levels in response to palmitate when compared to control. PE synthesis was slightly diminished; however, no compensatory changes in the PEMT pathway were observed. We next hypothesized that ER stress may be a potential mechanism by which palmitate treatment diminished choline. However, when we exposed primary hepatocytes to the common ER stress inducing compound tunicamycin, choline uptake, contrary to our expectation was augmented, concomitant with the transcript expression of choline transporters. Moreover, tunicamycin-induced ER stress divorced the observed increase in choline uptake from CDP-choline pathway flux since ER stress significantly diminished the incorporation and total PC content, similar to PE. Conclusion: Therefore, our results suggest that the altered FA milieu seen in obesity and fatty liver disease progression may adversely affect choline metabolism, but that compensatory mechanisms work to maintain phospholipid homeostasis.

Abstract Type 2 cytokines like IL-4 are hallmarks of helminth infection and activate macrophages to limit immunopathology and mediate helminth clearance. In addition to cytokines, nutrients and metabolites critically influence macrophage polarization. Choline is an essential nutrient known to support normal macrophage responses to lipopolysaccharide; however, its function in macrophages polarized by type 2 cytokines is unknown. Using murine IL-4-polarized macrophages, targeted lipidomics revealed significantly elevated levels of phosphatidylcholine, with select changes to other choline-containing lipid species. These changes were supported by the coordinated upregulation of choline transport compared to naïve macrophages. Pharmacological inhibition of choline metabolism significantly suppressed several mitochondrial transcripts and dramatically inhibited select IL-4-responsive transcripts, most notably, Retnla . We further confirmed that blocking choline metabolism diminished IL-4-induced RELMα (encoded by Retnla ) protein content and secretion and caused a dramatic reprogramming toward glycolytic metabolism. To better understand the physiological implications of these observations, naïve or mice infected with intestinal helminths Heligmosomoides polygyrus or Nippostrongylus brasiliensis were treated with the choline kinase α inhibitor, RSM-932A, to limit choline metabolism in vivo . Pharmacological inhibition of choline metabolism lowered RELMα expression across cell-types and tissues and led to the disappearance of peritoneal macrophages and B-1 lymphocytes and an influx of infiltrating monocytes. The impaired macrophage activation was associated with some loss in optimal immunity to H. polygyrus with increased egg burden, but there were no differences in intestinal worm count nor differences in N. brasiliensis parasite burden. Together, these data demonstrate that choline metabolism is required for macrophage RELMα induction, metabolic programming, and peritoneal immune homeostasis, which could have important implications in the context of other models of infection or cancer immunity. Abstract Figure

Abstract Objective Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD) represents a growing cause of mortality and morbidity and encompasses a spectrum of liver pathologies. Potential therapeutic targets have been identified and are currently being pre-clinically and clinically tested. However, while dozens of preclinical models have been developed to recapitulate various stages of MAFLD, few achieve fibrosis using an experimental design that mimics human pathogenesis. We sought to clarify whether the combination of thermoneutral (T N ) housing and consumption of a classical Western diet (WD) would accelerate the onset of MAFLD and progression in male and female mice. Methods Male and female C57Bl/6J mice were fed a nutrient-matched low-fat control or Western diet (41% Kcal from fat, 43% carbohydrate and 0.2% cholesterol; WD) starting at ∼12 wk of age for a further 16 wk. Mice were divided and housed with littermates at either standard temperature (T S ; 22°C) or thermoneutral conditions (T N ; ∼29°C). Mice underwent tests for glucose tolerance, insulin sensitivity and body composition, as well as intestinal permeability. Following tissue harvest, circulating and liver markers of hepatic disease progression toward steatosis and fibrosis were determined. Results While male mice housed at T N and fed a WD were significantly heavier than T S -housed control animals, no other differences in body weight or composition were observed. WD-fed females housed under T N conditions had higher circulating LDL-cholesterol; however, there were no other significant differences between T N and T S -housing in circulating or hepatic lipid levels. While WD-fed T N males had higher ALT levels, no other differences in markers of liver injury or disease progression were observed. Moreover, females housed at T N conditions and fed a WD remained significantly protected against the induction of fibrosis compared to male counterparts. Interestingly, sex-specific differences were observed in markers of glucose and insulin tolerance, where T N housing and WD feeding resulted in hyperglycemia and impaired insulin responsiveness in both sexes, but glucose intolerance only in male mice. Conclusions While T N housing has been demonstrated to exacerbate high fat-induced hepatic steatosis and inflammation in male and female mice, coupling T N housing with a WD for 16 wk was not sufficient to augment fatty liver progression in male or female mice. Highlights Thermoneutral housing and Western diet feeding does not progress to NASH Female mice are not more susceptible to obesity induced fatty liver under these conditions Temperature and diet had sex-specific effects on glucose tolerance and insulin sensitivity