Abstract It remains challenging to construct a complete cell lineage map of the origin of vascular endothelial cells in any vertebrate embryo. Here, we report the application of in toto light-sheet fluorescence imaging of embryos to tracing the origin of vascular endothelial cells (ECs) at single-cell resolution in zebrafish. We first adapted a previously-reported method to mount embryos and light-sheet imaging, created an a lignment, f usion, and e xtraction all- i n- o ne software (AFEIO) for processing big data, and performed quantitative analysis of cell lineage relationships using commercially-available Imaris software. Our data revealed that vascular ECs originated from broad regions of the gastrula along the dorsal-ventral and anterior-posterior axes, of which the dorsal-anterior cells contributed to cerebral ECs, the dorsal-lateral cells to anterior trunk ECs, and the ventral-lateral cells to posterior trunk and tail ECs. Therefore, this work, to our knowledge, charts the first comprehensive map of the gastrula origin of vascular ECs in zebrafish, and has potential applications for studying the origin of any embryonic organs in zebrafish and other model organisms.

Abstract Microglia surveillance manifests itself as dynamic changes in cell morphology and functional remodeling. Whether and how microglia surveillance is coupled to brain state switches during natural sleep-wake cycles remain unclear. To address this question, we used miniature two-photon microscopy (mTPM) to acquire time-lapse high-resolution microglia images of the somatosensory cortex, along with EEG/EMG recordings and behavioral video, in freely-behaving mice. We uncovered fast and robust brain state-dependent changes in microglia surveillance, occurring in parallel with sleep dynamics and early-onset phagocytic microglial contraction during sleep deprivation stress. We also detected local norepinephrine fluctuation occurring in a sleep state-dependent manner. We showed that the locus coeruleus-norepinephrine system, which is crucial to sleep homeostasis, is required for both sleep state-dependent and stress-induced microglial responses and β 2 -adrenergic receptor signaling plays a significant role in this process. These results provide direct evidence that microglial surveillance is exquisitely tuned to signals and stressors that regulate sleep dynamics and homeostasis so as to adjust its varied roles to complement those of neurons in the brain. In vivo imaging with mTPM in freely behaving animals, as demonstrated here, opens a new avenue for future investigation of microglia dynamics and sleep biology in freely behaving animals.

ABSTRACT OBJECTIVE Macrophage phagocytosis function is critical for tissue homeostasis, but excessive phagocytosis leads to lipid overloading and foam cell formation, a hallmark of atherosclerosis. However, regulatory mechanisms of phagocytosis under atherogenic conditions remain poorly understood. We previously reported that macrophage oxLDL/CD36 signaling drives mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) production during atherosclerosis initiation. Here we aim to determine the role of CD36-mtROS axis in regulation of phagocytosis and explore the underlying molecular mechanism, which could provide new potential therapeutic targets. METHODS AND RESULTS Feeding macrophages with a variety of large particles including pHrodo-conjugated E.coli, green fluorescence beads, and fluorescence-labeled apoptotic cells, we showed that oxLDL upregulated phagocytosis efficiency in macrophages. This effect was dependent on CD36 as it was attenuated in Cd36 -null macrophages. Through use of mtROS scavenger MitoTEMPO, MCAT transgenic strategy and antioxidant signaling stimulation, we observed that mtROS were required for oxLDL-upregulated phagocytosis. Using the atherosclerosis-prone Apoe -null mouse model, we found that aortic foamy macrophages displayed both elevated levels of mtROS and phagocytosis functions during the initiation of atherosclerosis. Employing a combination of co-immunoprecipitation, mass spectrometry, genetic knockdown by siRNA, and small chemical inhibitors, we identified a cytosolic enzyme PKM2 downstream of oxLDL/CD36 signaling, which translocated to the mitochondria with the assistance of a chaperone GRP75. Subsequently, mitochondrial PKM2 bound to the electron transport chain Complex III, potentially facilitating mtROS production. CONCLUSIONS These findings reveal a novel CD36-PKM2-mtROS pathway in macrophages that could lead to excess phagocytosis during the initiation of atherosclerosis.