Summary Classical neurotransmitters are mainly known for their roles as neuromodulators, but they also play important roles in the control of developmental and regenerative processes. Here, we used the lamprey model of spinal cord injury to study the effect of serotonin in axon regeneration at the level of individually identifiable descending neurons. Pharmacological and genetic treatments after a complete spinal cord injury showed that endogenous serotonin inhibits axonal regeneration in identifiable descending neurons through the activation of serotonin 1A receptors and a subsequent decrease in cAMP levels. RNA sequencing revealed that changes in the expression of genes that control axonal guidance could be a key factor on the serotonin effects during regeneration. This study provides new targets of interest for research in non-regenerating mammalian models of traumatic CNS injuries and extends the known roles of serotonin signalling during neuronal regeneration.

Abstract Purpose Gasdermin B (GSDMB) over-expression promotes poor prognosis and aggressive behavior in HER2 breast cancer by increasing cell invasion, metastasis and resistance to therapy. Decoding the molecular mechanism of GSDMB-mediated drug resistance is crucial to identify novel effective targeted treatments for HER2/GSDMB aggressive tumors. Experiment design To decipher the functional relevance of GSDMB in promoting resistance to HER2-targeted therapies we performed several molecular approaches (immunoblot, qRT-PCR, flow cytometry, immunoprecipitation and confocal microscopy) in different breast and gastric carcinoma cell models. The results were confirmed in Patient Derived Xenografts (PDX) by qRT-PCR and in clinical human cancer samples by immunohistochemistry. Finally, we validated the efficacy of the identified targeted treatment in HER2/GSDMB cancers using two complementary in vivo preclinical models (tumor xenografts in mice and zebrafish). Results We discovered that GSDMB up-regulation renders HER2 breast and gastric cancer cells more resistant to anti-HER2 agents by promoting protective autophagy. Consistent with this, we proved that the combination of lapatinib with the autophagy inhibitor chloroquine increases the therapeutic response specifically in GSDMB-positive tumors in vitro and in vivo using zebrafish and mice preclinical cancer models. Mechanistically, we confirmed that the GSDMB N-terminal domain interacts with the autophagy protein LC3B. Finally, we validated these results in clinical samples of breast and gastric cancers, where GSDMB/LC3B co-expression associates significantly with relapse. Conclusion Our findings uncovered a novel functional link between GSDMB over-expression and LC3B-mediated protective autophagy in response to HER2-targeted therapies and provide a new and accessible therapeutic approach for HER2/GSDMB+ cancers with adverse clinical outcome. TRANSLATIONAL RELEVANCE Identifying the biomarkers and mechanisms of therapy resistance is a main challenge in current oncology. In this regard, Gasdermin-B (GSDMB) over-expression, which was initially found in >60% HER2 breast cancers, promotes resistance to therapy through an unknown molecular mechanism. In the present work, we revealed for the first time that in HER2 gastric and breast cancers GSDMB mediates innate and acquired resistance to HER2-targeted drugs through the promotion of a pro-survival autophagy mechanism that requires the interaction of GSDMB with LC3B. Accordingly, GSDMB/LC3B co-expression in human breast and gastric cancer clinical samples associates with relapse. To reverse this anti-drug effect, we developed a therapeutic approach based on the combination of the autophagy inhibitor chloroquine with lapatinib that showed significant efficacy both in vitro and in vivo on GSDMB-positive tumors. Our findings provide an accessible (FDA-approved drugs) therapeutic combination to treat effectively HER2/GSDMB over-expressing tumors with poor clinical outcome.

Abstract The dynamic intercommunication between tumour cells and cells from the microenvironment, such as cancer-associated fibroblast (CAFs), is a key factor driving breast cancer (BC) metastasis. Clusters of circulating tumour cells (CTCs), known to bare a higher efficiency at establishing metastases, are found in the blood of BC patients, often accompanied by CAFs in heterotypic CTC-clusters. Previously we have shown the utility of CTC-clusters models and the zebrafish embryo as a model of metastasis to understand the biology of breast cancer CTC-clusters. In this work, we use the zebrafish embryo to study the interactions between CTCs in homotypic clusters and CTC-CAFs in heterotypic CTC-clusters to identify potential pro-metastatic traits derived from CTC-CAF communication. We found that upon dissemination CAFs seem to exert a pro-survival and pro-proliferative effect on the CTCs, but only when CTCs and CAFs remain joined as cell clusters. Our data indicate that the clustering of CTC and CAF allows the establishment of physical interactions that when maintained over time favour the selection of CTCs with a higher capacity to survive and proliferate upon dissemination. Importantly, this effect seems to be dependent on the survival of disseminated CAFs and was not observed in the presence of normal fibroblasts. Moreover, we show that CAFs can exert regulatory effects on the CTCs without being involved in promoting tumour cell invasion, and these effects are differential based on the BC cell molecular phenotype, and the crosstalk between tumour cells and CAFs, i.e. paracrine or physical interaction. Lastly, we show that the physical communication between BC cells and CAFs leads to the production of soluble factors involved in BC cell survival and proliferation. These findings suggest the existence of a CAF-regulatory effect on CTC survival and proliferation sustained by cell-to-cell contacts and highlight the need to understand the molecular mechanisms that mediate the interaction between the CTCs and CAFs in clusters enhancing the metastatic capacity of CTCs.

Abstract Chromosomal instability (CIN) is an important source of genetic and phenotypic variation that has been extensively reported as a critical cancer related property that improves tumor cell adaptation and survival. CIN and its immediate consequence, aneuploidy, provoke adverse effects on cellular homeostasis that need to be overcome by developing efficient anti-stress mechanisms. Perturbations in these safeguard responses might be detrimental for cancer cells and represent an important tumor specific Achilles heel since CIN and aneuploidy are very rare events in normal cells. On the other hand, epitranscriptomic marks catalyzed by different RNA modifying enzymes have been found to change under several stress insults. Although CIN and aneuploidy are important intracellular stressors, their biological connection with RNA modifications is pending to be determined. In an in silico search for new cancer biomarkers, we have identified TRMT61B, a mitochondrial RNA methyltransferase enzyme, to be associated with high levels of aneuploidy. In the present work, we study the connection of this molecule with cancer and aneuploidy. First, we show increased protein amounts of TRMT61B in tumor cell lines with imbalanced karyotype as well as in different tumor types compared to unaffected control tissues. In addition, we demonstrate that depletion of TRMT61B in melanoma cells reduces cell proliferation either by fostering apoptosis and inhibiting autophagy in high-aneuploid (ANE high ) cells or by inducing senescence in the case of low-aneuploid (ANE low ) cell lines. Further, TRMT61B elimination compromises mitochondrial function and reduces the expression of several mitochondrial encoded proteins that are part of the electron transport chain. Finally, transwell and xenograft experiments revealed a reduced invasive and tumorigenic capacity upon TRMT61B depletion that strengthen the therapeutic value of this aneuploidy-associated biomarker. These results, which connect tumorigenesis, aneuploidy and mitochondrial RNA methylation, bring to the cancer field a new putative strategy to specifically target high aneuploid tumors.

Abstract Neurogenesis is the process by which progenitor cells generate new neurons. As development progresses neurogenesis becomes restricted to concrete neurogenic niches, where it persists during postnatal life. The retina of teleost fishes is thought to proliferate and produce new cells throughout life. Whether this capacity may be an ancestral characteristic of jawed vertebrates, shared with chondrichthyans, which diverged from osteichthyans prior to the gnathostome radiation is completely unknown. Previous work from our group revealed that the juvenile retina of the catshark Scyliorhinus canicula shows active proliferation and neurogenesis. Here, we compared the morphology and proliferative status of the retina between catshark juveniles and adults. Histological analyses revealed an important reduction in the size of the peripheral retina (where progenitor cells are mainly located), an increase in the thickness of the plexiform layers and a decrease in the thickness of the inner nuclear layer in adults. Contrary to what has been reported in teleost fish, we did not observe active mitotic activity in the catshark retina after sexual maturation, suggesting that there is no significant proliferation and neurogenesis in adult specimens. Based on these results, we carried out RNA-Sequencing (RNA-Seq) analyses comparing the retinal transcriptome of juveniles and adults, which revealed a statistically significant decrease in the expression of many genes involved in cell proliferation and neurogenesis in adult catsharks. Our RNA-Seq data provides an excellent resource to identify new signaling pathways controlling neurogenesis in the vertebrate retina.

ABSTRACT Niemann Pick disease type C (NPC) is an autosomal recessive neurodegenerative lysosomal disorder characterized by an accumulation of lipids in different organs. Clinical manifestations can start at any age and include hepatosplenomegaly, intellectual impairment, and cerebellar ataxia. NPC1 is the most common causal gene, with over 460 different mutations with heterogeneous pathological consequences. We generated a zebrafish NPC1 model by CRISPR/Cas9 carrying a homozygous mutation in exon 22, which encodes the end of the cysteine-rich luminal loop of the protein. This is the first zebrafish model with a mutation in this gene region, which is frequently involved in the human disease. We observed a high lethality in npc1 mutants, with all larvae dying before reaching the adult stage. Npc1 mutant larvae were smaller than wild type (wt) and their motor function was impaired. We observed vacuolar aggregations positive to cholesterol and sphingomyelin staining in the liver, intestine, renal tubules and cerebral gray matter of mutant larvae. RNAseq comparison between npc1 mutants and controls showed 249 differentially expressed genes, including genes with functions in neurodevelopment, lipid exchange and metabolism, muscle contraction, cytoskeleton, angiogenesis, and hematopoiesis. Lipidomic analysis revealed significant reduction of cholesteryl esters and increase of sphingomyelin in the mutants. Compared to previously available zebrafish models, our model seems to recapitulate better the early onset forms of the NPC disease. Thus, this new model of NPC will allow future research in the cellular and molecular causes/consequences of the disease and on the search for new treatments.

Abstract It is largely assumed that the fish retina shows continuous and active proliferative and neurogenic activity throughout life. This is based on studies in teleost models. However, work in lampreys and cartilaginous fishes has shown that proliferative and mitotic activity is almost absent in adult individuals of these ancient fish groups. Interestingly, when deepening in the teleost literature one finds that claims of a highly active and continuous proliferation in the adult retina are based on studies in which proliferation was not quantified in a comparative way at different life stages or was mainly studied in juveniles/young adults. Here, we performed a systematic and comparative study of the constitutive proliferative activity of the retina from early developing (2 days post-fertilization) to aged (up to 3-4 years post-fertilization) zebrafish. Cell proliferation was analysed by using immunofluorescence against pH3 (marker of mitotic cells) and PCNA (marker of proliferating cells). We observed a decline in cell proliferation in the whole retina with ageing, even despite the occurrence of a wave of secondary proliferation during sexual maturation. Interestingly, during this wave of secondary proliferation the distribution of proliferating and mitotic cells changes from the inner to the outer nuclear layer in the central retina. Importantly, in aged zebrafish there is a virtual disappearance of mitotic activity. Our results showing a decline in proliferative activity of the zebrafish retina with ageing are of crucial importance since it is largely assumed that the fish retina grows continuously throughout life from progenitor cells located in the periphery.

Abstract Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deadliest tumors, partly due to its intrinsic aggressiveness, metastatic potential, and chemoresistance of the contained cancer stem cells (CSCs). Pancreatic CSCs strongly rely on mitochondrial metabolism to maintain their stemness, therefore representing a putative target for their elimination. Since mitochondrial homeostasis depends on the tightly controlled balance between fusion and fission processes, namely mitochondrial dynamics, we aimed to study this mechanism in the context of stemness. In human PDAC tissues, the mitochondrial fission gene DNM1L (DRP1) was overexpressed and positively correlated with the stemness signature. Moreover, we observed that primary human CSCs display smaller mitochondria and a higher DRP1/MFN2 expression ratio, indicating activation of mitochondrial fission. Interestingly, treatment with the DRP1 inhibitor mDivi-1 induced dose-dependent apoptosis, especially in CD133 + CSCs, due to accumulation of dysfunctional mitochondria and subsequent energy crisis in this subpopulation. Mechanistically, mDivi-1 inhibited stemness-related features, such as self-renewal, tumorigenicity and invasiveness, and chemosensitized the cells to the cytotoxic effects of Gemcitabine. In summary, mitochondrial fission is an essential process for pancreatic CSCs and represents an attractive target for designing novel multimodal treatments that will more efficiently eliminate cells with high tumorigenic potential. Simple Summary Due to their intrinsic aggressiveness, cancer stem cells (CSCs) represent an essential target for the design of effective treatments against pancreatic cancer, one of the deadliest tumors. As pancreatic CSCs are particularly dependent on the activity of their mitochondria, we here focus on mitochondrial dynamics as a critical process in the homeostasis of these organelles. We found that pancreatic CSCs rely on mitochondrial fission, and its pharmacological inhibition by mDivi-1 resulted in the accumulation of dysfunctional mitochondria, provoking energy crisis and cell death in this subpopulation. Consequently, mDivi-1 blocked cellular functions related to cancer aggressiveness such as in vivo tumorigenicity, invasiveness and chemoresistance. Our data suggest that inhibition of mitochondrial fission represents a promising target for designing new multimodal therapies to fight pancreatic cancer.

Abstract FOXL2 is a transcription factor essential for sex determination and ovary development and maintenance. Mutations in this gene are implicated in syndromes involving premature ovarian failure and granulosa cell tumors (GCTs). This rare cancer accounts for less than 5% of diagnosed ovarian cancers and is causally associated with the FOXL2 c.402C>G, p.C134W mutation in 97% of the adult cases (AGCTs). In this study, we employed CRISPR technology to specifically eliminate the FOXL2 c.402C>G mutation in granulosa tumor cells. Our results show that this Cas9-mediated strategy selectively targets the mutation without affecting the wild-type allele. Granulosa cells lacking the FOXL2 c.402C>G exhibit a reduced malignant phenotype, with significant changes in cell proliferation, invasion, and cell death. Furthermore, these modified cells are more susceptible to Dasatinib and Ketoconazole. Transcriptomic and proteomic analyses reveal that CRISPR-modified granulosa tumor cells shift their expression profiles towards a wild-type like phenotype. Additionally, this altered expression signature has led to the identification of new compounds with antiproliferative and pro-apoptotic effects on granulosa tumor cells. Our findings demonstrate the potential of CRISPR technology for the specific targeting and elimination of a mutation causing granulosa cell tumors, highlighting its therapeutic promise for treating this rare ovarian cancer. Simple Summary Adult granulosa cell tumors (AGCTs), characterized by a specific point mutation (C134W) in the gene FOXL2, are less than 5% of all the diagnosed ovarian cancers. Surgery is the cornerstone treatment for AGCT even at relapse, with systemic therapy showing poor results. The aim of our study is to explore the potential therapeutic effect of the elimination of the C134W mutation. To achieve our goal, we have eliminated the mutant allele using CRISPR technology. Our results demonstrate that CRISPR-mediated elimination of FOXL2-C134W reduces the malignant phenotype of granulosa tumor cells, which change their transcriptional, proteomic, and cellular phenotype to a wild type like, granulosa type. Moreover, the induced changes allowed us to find new compounds with antitumoral activity. This work highlights the therapeutic potential of CRISPR mediated technology for the treatment of AGCT.

Abstract Epilepsies are a common and severe neurological condition characterized by spontaneous and recurrent seizures. Although anti-seizure medications are effective for most patients, about 30% remain pharmacoresistant. Moreover, uncontrolled seizures are associated with risk factors and shortened life expectancy for individuals with refractory epilepsy. Preclinical studies are an essential step for drug discovery and the zebrafish ( Danio rerio ) has been successfully employed for this purpose. In this study, we applied the zebrafish PTZ-seizure model to investigate the effect of two compounds on seizure suppression, Tripeptide (p-BTX-I) and the Cx43 peptide CX2. Zebrafish larvae at 6 days post-fertilization (dpf) were exposed to both compounds, according to their group, 24h prior to PTZ-seizure induction. We quantified the compounds’ effect on seizure latency, number of seizures and transcript levels of genes related to inflammation, oxidative stress, and apoptosis ( il1b, tnfa, cox1, cox2a, il6, casp3a, casp9, baxa, bcl2a, nox1, sod1 and cat ). Our results showed that CX2 at a concentration of 0.1 μM/mL yielded the best outcome for seizure suppression as it reduced the number of seizures and increased the seizure latency. Additionally, CX2 treatment before PTZ-induced seizures decreased the transcript of il1b, il6, tnfa and cox1 genes, all related to inflammation. A bio-distribution study showed that the CX2 reached the zebrafish brain at both times investigated, 1h and 6h. Similarly, the tripeptide exhibited anti-inflammatory and anti-apoptotic action, reducing mRNA expression of the il1b and casp9 genes. Our findings suggest that both Tripeptide and CX2 hold translational potential for seizure suppression.