Abstract The rapid promotion of single-cell omics in various fields has begun to help solve many problems encountered in research including precision medicine, prenatal diagnosis, and embryo development. Meanwhile, single-cell techniques are also constantly updated with increasing demand. For some specific target cells, the workflow from droplet screening to single-cell sequencing is a preferred option, which also should reduce the impact of operation steps such as demulsification and cell recovery. We developed an all-in-droplet method integrating cell encapsulation, target sorting, droplet picoinjection, and single-cell transcriptome profiling on chips to achieve a labor-saving monitor of TCR-T cells. As a proof of concept, in this research, TCR-T cells were encapsulated, sorted, and performed single-cell transcriptome sequencing (scRNA-seq) by injecting reagents into droplet. It avoided the tedious operation of droplet breakage and re-encapsulation between droplet sorting and scRNA-seq. Moreover, convenient device operation will accelerate the progress of chip marketization. The strategy achieved an excellent recovery performance of single cell transcriptome with a median gene number over 4000 and a cross-contamination rate of 8.2 ± 2%. Furthermore, this strategy allows us to develop a device with high integrability to monitor infused TCR-T cells, which will promote the development of adoptive T cell immunotherapy and their clinical application.

Summary T-cell receptor (TCR)-engineered T cells can precisely recognize a broad repertoire of targets derived from both intracellular and surface proteins of tumor cells. TCR-T adoptive cell therapy has shown safety and promising efficacy in solid tumor immunotherapy. However, antigen-specific functional TCR screening is time-consuming and expensive, which limits its application clinically. Here, we developed a novel integrated antigen-TCR screening platform based on droplet microfluidics technology, enabling high-throughput peptide-major histocompatibility complex (pMHC) library-to-TCR library screening with high sensitivity and low background signal. We introduced DNA barcoding technology to label peptide antigen candidate-loaded antigen-presenting cells (APCs) and Jurkat reporter cells to check the specificity of pMHC-TCR candidates. Coupled with the next-generation sequencing pipeline, interpretation of the DNA barcodes and the gene expression level of the Jurkat T-cell activation pathway provided a clear peptide-MHC-TCR recognition relationship. Our proof-of-principle study demonstrates that the platform could achieve unbiased pMHC-TCR library-on-library screening, which is expected to be used in the cross-reactivity and off-target testing of candidate pMHC-TCR libraries in clinical applications.