ABSTRACT Many drugs have the potential to induce the expression of drug-metabolizing enzymes, particularly cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), in hepatocytes. Hepatocytes can accurately evaluate drug-mediated CYP3A4 induction as the gold standard for in vitro hepatic toxicology test, but their lot variation is an issue to be solved. Only a limited number of immortalized hepatocyte cells have been reported. In this study, we generated an immortalized cell expressing CYP3A4 from a patient with drug-induced liver injury (DILI). To generate DILI-derived cells with a high expression of CYP3A4, we employed a three-step approach: 1. Differentiation of DILI-induced pluripotent stem cells (DILI-iPSCs); 2. Immortalization of the differentiated cells; 3. Selection of the cells with puromycin. We hypothesize that cells with a high expression of cytochrome P450 genes can survive even after exposure to cytotoxic antibiotics because of high drug-metabolism activity. Puromycin, one of the cytotoxic antibiotics, was used in this study because of its rapid cytocidal effect at a low concentration. Phenotypic studies in vitro revealed that the puromycin-selected cells (HepaSM or SI cells) constitutively expressed the CYP3A4 gene at an extremely high level, and continued to proliferate at least up to 34 population doublings for more than 250 days. The expression profiles were independent of population doublings. Drug-mediated induction test revealed that the cells significantly increased CYP3A4 after exposure to rifampicin, suggesting that the immortalized cells would serve as another useful source for in vitro examination of drug metabolism and CYP3A4 induction.

A large number of myocytes is necessary to treat intractable muscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy with cell-based therapies. However, starting materials for cellular therapy products such as myoblasts, marrow stromal cells, menstrual blood-derived cells and placenta-derived cells have a limited lifespan and cease to proliferate in vitro. From the viewpoints of manufacturing and quality control, cells with a long lifespan are more suitable as a starting material. In this study, we generated stromal cells for future myoblast therapy from a working cell bank of human embryonic stem cells (ESCs). The ESC-derived CD105+ cells with extensive in vitro proliferation capability exhibited myogenesis and genetic stability in vitro. These results imply that ESC-derived CD105+ cells are another cell source for myoblasts in cell-based therapy for patients with genetic muscular disorders. Since ESCs are immortal, mesenchymal stromal cells generated from ESCs can be manufactured at a large scale in one lot for pharmaceutical purposes.

Abstract Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) are established by introducing several reprogramming factors, such as OCT3/4 , SOX2 , KLF4 , c-MYC . Because of their pluripotency and immortality, iPSCs are considered to be a powerful tool for regenerative medicine. To date, iPSCs have been established all over the world by various gene delivery methods. All methods induced high-quality iPSCs, but epigenetic analysis of abnormalities derived from differences in the gene delivery methods has not yet been performed. Here, we generated genetically matched human iPSCs from menstrual blood cells by using three kinds of vectors, i.e., retrovirus, Sendai virus, and episomal vectors, and compared genome-wide DNA methylation profiles among them. Although comparison of aberrant methylation revealed that iPSCs generated by Sendai virus vector have lowest number of aberrant methylation sites among the three vectors, the iPSCs generated by non-integrating methods did not show vector-specific aberrant methylation. However, the differences between the iPSC lines were determined to be the number of random aberrant hyper-methylated regions compared with embryonic stem cells. These random aberrant hyper-methylations might be a cause of the differences in the properties of each of the iPSC lines.

Background: Hepatocytes are an important tool for in vitro toxicology testing. In addition to primary cultures, a limited number of immortalized cell lines have been developed. We here describe a new cell line, designated as HepaMN, which has been established from a liver associated with biliary atresia. Methods: Hepatocytes were isolated from a liver of 4-year-old girl with biliary atresia and immortalized by inoculation with CSII-CMV-TERT, CSII-CMV-Tet-Off, CSII-TRE-Tight-cyclin D1 and CSII-TRE-Tight-CDK4R24C (mutant CDK4: an INK4a-resistant form of CDK4) lentiviruses at the multiplicity of infection of 3 to 10. Results: HepaMN cells exhibited morphological homogeneity, displaying hepatocyte-like phenotypes. Phenotypic studies in vivo and in vitro revealed that HepaMN cells showed polarized and functional hepatocyte features along with a canalicular cell phenotype under defined conditions, and constitutively expressed albumin and carbamoyl phosphate synthetase I in addition to epithelial markers. Since HepaMN cells are immortal and subcloned, kinetics and expression profiles were independent of population doublings. Conclusions: HepaMN cells showed increased CYP3A4 expression after exposure to rifampicin, implying that their close resemblance to normal human hepatocytes makes them suitable for research applications including drug metabolism studies.

Gorlin syndrome is a rare autosomal dominant hereditary disease with high incidence of tumors such as basal cell carcinoma and medulloblastoma. Disease-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) have now been used as a model to analyze disease pathogenesis as well as an animal model. In this study, we generated iPSCs derived from fibroblasts of four patients with Gorlin syndrome (Gln-iPSCs) with a heterozygous mutation of the PTCH1 gene. Gln-iPSCs from the four patients developed medulloblastoma in 100% (four out of four), a manifestation of Gorlin syndrome, in the teratomas after implantation into immunodeficient mice, but none (0/584) of the other iPSC-teratomas. One of the medulloblastomas had loss of heterozygosity in the PTCH1 gene while benign teratoma, i.e. non-medulloblastoma part, did not, indicating a close clinical correlation between tumorigenesis in Gorlin syndrome patients and Gln-iPSCs.

ABSTRACT In recent years, the number of infections caused by non-tuberculous mycobacteria has increased worldwide, and infections caused by Mycobacterium abscessus ( M. abscessus ) are often difficult to treat due to their multidrug resistance. Research into the mechanisms of multidrug resistance in M. abscessus has focused on genetic mutations but not on genetic mobile elements such as plasmids. We performed a comparative genomic analysis of clinical isolates of M. abscessus collected from the same patient at different time points. Antimicrobial susceptibility testing showed that these clinical isolates had decreased susceptibility to carbapenem antibiotics compared to the type strain. Although the isolates had relatively few chromosomal mutations, they harboured three plasmids not found in the type strain. Two of the three plasmids encoded genes such as the ESX secretion system, and the other encoded the MMPL family transporter. We also mapped the sequence data from clinical isolates collected worldwide to these plasmid sequences. The data from 2.2% and 11.3% of isolates were mapped entirely to two of these plasmid sequences, respectively. These results indicate that these plasmids have been horizontally transferred among clinical isolates of M. abscessus worldwide and provide new insights into the acquisition of multidrug resistance in M. abscessus . Graphical Abstract

ABSTRACT As a metabolic organ, the liver plays a variety of roles, including detoxification. It has been difficult to obtain stable supplies of hepatocytes for transplantation and for accurate hepatotoxicity determination in drug discovery research. Human pluripotent stem cells, capable of unlimited self-renewal, may be a promising source of hepatocytes. In order to develop a stable supply of embryonic stem cell (ESC)-derived hepatocytes, we have purified human ESC-derived hepatic progenitor cells with exposure to cytocidal puromycin by using their ability to metabolize drugs. Hepatic progenitor cells stably proliferated at least 2^20-fold over 120 days, maintaining hepatic progenitor cell-like properties. High drug-metabolizing hepatic progenitor cells can be matured into liver cells by suppressing hepatic proliferative signals. The method we developed enables the isolation and proliferation of functional hepatic progenitors from human ESCs, thereby providing a stable supply of high-quality cell resources at high efficiency. Cells produced by this method may facilitate cell therapy for hepatic diseases and reliable drug discovery research.

SUMMARY Hepatocytes can be used to study the pathogenesis of liver diseases and drug discovery research. Human hepatocytes are, however, hardly expandable in vitro making it difficult to secure large numbers of cells from one donor. In this study, we aimed to establish an in vitro long-term culture system that enables stable proliferation and maintenance of human hepatocytes to ensure a constant supply. We purified human hepatocytes by selection with cytocidal puromycin, and cultured them for more than 60 population doublings over a span of more than 350 days. These results show that this simple culture system with usage of the cytocidal antibiotics enables efficient hepatocyte proliferation and is an effective method for generating a stable supply of hepatocytes for drug discovery research at a significant cost reduction.

ABSTRACT Hepatocyte-like cells (HLCs) generated from human pluripotent stem cells (PSCs) exhibit hepatocytic properties in vitro; however, their engraftment and functionality in vivo remain unsatisfactory. Despite optimization of differentiation protocols, HLCs did not engraft in a mouse model of liver injury. In contrast, organ-derived hepatocytes reproducibly formed colonies in the liver injury mouse model. As an extension of the phenomenon observed in hematopoietic stem cells giving rise to colonies within the spleen, commonly referred to as “colony-forming units in spleen (CFU-s“, we hypothesize that “colony-forming units in liver (CFU-L)“ serves as a reliable indicator of stemness, engraftment, and functionality of hepatocytes. The uniform expression of the randomly inactivated gene in a single colony, as reported by Sugahara et al. 2022, suggests that the colonies generated by isolated hepatocytes likely originate from a single cell. We, therefore, propose that CFU-L can be used to quantify the number of “hepatocytes that engraft and proliferate in vivo“ as a quantitative assay for stem cells that utilize colony-forming ability, similar to that observed in hematopoietic stem cells.