Activated human T lymphocytes exposed to apoptotic stimuli targeting mitochondria (i.e. staurosporine), enter an early, caspase-independent phase of commitment to apoptosis characterized by cell shrinkage and peripheral chromatin condensation. We show that during this phase, AIF is selectively released from the intermembrane space of mitochondria, and that Bax undergo conformational change, relocation to mitochondria, and insertion into the outer mitochondrial membrane, in a Bid-independent manner. We analyzed the subcellular distribution of cathepsins (Cat) B, D, and L, in a search for caspase-independent factors responsible for Bax activation and AIF release. All were translocated from lysosomes to the cytosol, in correlation with limited destabilization of the lysosomes and release of lysosomal molecules in a size selective manner. However, only inhibition of Cat D activity by pepstatin A inhibited the early apoptotic events and delayed cell death, even in the presence of bafilomycin A1, an inhibitor of vacuolar type H+-ATPase, which inhibits acidification in lysosomes. Small interfering RNA-mediated gene silencing was used to inactivate Cat D, Bax, and AIF gene expression. This allowed us to define a novel sequence of events in which Cat D triggers Bax activation, Bax induces the selective release of mitochondrial AIF, and the latter is responsible for the early apoptotic phenotype. Activated human T lymphocytes exposed to apoptotic stimuli targeting mitochondria (i.e. staurosporine), enter an early, caspase-independent phase of commitment to apoptosis characterized by cell shrinkage and peripheral chromatin condensation. We show that during this phase, AIF is selectively released from the intermembrane space of mitochondria, and that Bax undergo conformational change, relocation to mitochondria, and insertion into the outer mitochondrial membrane, in a Bid-independent manner. We analyzed the subcellular distribution of cathepsins (Cat) B, D, and L, in a search for caspase-independent factors responsible for Bax activation and AIF release. All were translocated from lysosomes to the cytosol, in correlation with limited destabilization of the lysosomes and release of lysosomal molecules in a size selective manner. However, only inhibition of Cat D activity by pepstatin A inhibited the early apoptotic events and delayed cell death, even in the presence of bafilomycin A1, an inhibitor of vacuolar type H+-ATPase, which inhibits acidification in lysosomes. Small interfering RNA-mediated gene silencing was used to inactivate Cat D, Bax, and AIF gene expression. This allowed us to define a novel sequence of events in which Cat D triggers Bax activation, Bax induces the selective release of mitochondrial AIF, and the latter is responsible for the early apoptotic phenotype. If activated primary T lymphocytes are exposed to apoptotic stimuli that do not rely on death receptors (such as anti-CD2 and staurosporine), they undergo a definitive sequence of apoptotic events (1Dumont C. Durrbach A. Bidere N. Rouleau M. Kroemer G. Bernard G. Hirsch F. Charpentier B. Susin S.A. Senik A. Blood. 2000; 96: 1030-1038Crossref PubMed Google Scholar, 2Bidere N. Senik A. Apoptosis. 2001; 6: 371Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar). This sequence begins with an early phase of commitment to apoptosis, characterized by cell shrinkage, peripheral chromatin condensation, and the partial efflux of apoptosis-inducing factor (AIF) 1The abbreviations used are: AIF, apoptosis-inducing factor; Baf A1, bafilomycin A1; Cat, cathepsin; Cox II, cytochrome c oxydase subunit II; EndoG, endonuclease G; IL, interleukin; OMM, outer mitochondrial membrane; siRNA, small interfering RNA; STS, staurosporine; tBid, truncated Bid; PBS, phosphate-buffered saline; Z, benzyloxycarbonyl; FITC, fluorescein isothiocyanate; DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; CHAPS, 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid; mAb, monoclonal antibody; fmk, fluoromethylketone. from mitochondria to the cytosol and the nucleus. No caspase activation is observed and thus, internucleosomic DNA fragmentation does not occur. Cytochrome c is subsequently released from mitochondria, and the inner mitochondrial transmembrane potential (ΔΨm) is simultaneously dissipated. These two events constitute a "point of no-return" coinciding with amplification of the caspase cascade and achievement of the apoptotic phenotype. AIF is an apoptogenic flavoprotein, which resides in the intermembrane space of mitochondria and is translocated, in a caspase-independent manner, to the cytosol and the nucleus in response to apoptotic stimuli (3Susin S.A. Lorenzo H.K. Zamzami N. Marzo I. Snow B.E. Brothers G.M. Mangion J. Jacotot E. Costantini P. Loeffler M. Larochette N. Goodlett D.R. Aebersold R. Siderovski D.P. Penninger J.M. Kroemer G. Nature. 1999; 397: 441-446Crossref PubMed Scopus (3452) Google Scholar, 4Joza N. Susin S.A. Daugas E. Stanford W.L. Cho S.K. Li C.Y. Sasaki T. Elia A.J. Cheng H.Y. Ravagnan L. Ferri K.F. Zamzami N. Wakeham A. Hakem R. Yoshida H. Kong Y.Y. Mak T.W. Zuniga-Pflucker J.C. Kroemer G. Penninger J.M. Nature. 2001; 410: 549-554Crossref PubMed Scopus (1153) Google Scholar). In the nuclei, it stimulates peripheral chromatin condensation and large-scale 50-kb DNA fragmentation (5Susin S.A. Daugas E. Ravagnan L. Samejima K. Zamzami N. Loeffler M. Costantini P. Ferri K.F. Irinopoulou T. Prevost M.C. Brothers G. Mak T.W. Penninger J. Earnshaw W.C. Kroemer G. J. Exp. Med. 2000; 192: 571-580Crossref PubMed Scopus (663) Google Scholar, 6Loeffler M. Daugas E. Susin S.A. Zamzami N. Metivier D. Nieminen A.L. Brothers G. Penninger J.M. Kroemer G. Faseb J. 2001; 15: 758-767Crossref PubMed Scopus (211) Google Scholar). The partial release of mitochondrial AIF, but not of cytochrome c, observed in T cells after their commitment to apoptosis, suggests that only limited permeabilization of the outer mitochondrial membrane (OMM) occurs at this time. In neurons treated with camptothecin, AIF release is dependent on Bax, a pro-apoptotic member of the Bcl-2 protein family (7Cregan S.P. Fortin A. MacLaurin J.G. Callaghan S.M. Cecconi F. Yu S.W. Dawson T.M. Dawson V.L. Park D.S. Kroemer G. Slack R.S. J. Cell Biol. 2002; 158: 507-517Crossref PubMed Scopus (426) Google Scholar). In Caenorhabditis elegans, the mitochondrial release of WAH-1, a homolog of AIF, is promoted by the BH3-domain protein, EGL-1 (8Wang X. Yang C. Chai J. Shi Y. Xue D. Science. 2002; 298: 1587-1592Crossref PubMed Scopus (329) Google Scholar). We therefore thought that Bax might cause AIF relocation in the cells of our system. Bax is present as an inactive monomer in the cytosol. Upon the induction of apoptosis, it is translocated to mitochondria, and becomes inserted via its C terminus into the OMM, where it forms homo-oligomers, provoking membrane permeabilization (9Wolter K.G. Hsu Y.T. Smith C.L. Nechushtan A. Xi X.G. Youle R.J. J. Cell Biol. 1997; 139: 1281-1292Crossref PubMed Scopus (1577) Google Scholar, 10Goping I.S. Gross A. Lavoie J.N. Nguyen M. Jemmerson R. Roth K. Korsmeyer S.J. Shore G.C. J. Cell Biol. 1998; 143: 207-215Crossref PubMed Scopus (549) Google Scholar, 11Gross A. Jockel J. Wei M.C. Korsmeyer S.J. EMBO J. 1998; 17: 3878-3885Crossref PubMed Scopus (966) Google Scholar, 12Antonsson B. Montessuit S. Sanchez B. Martinou J.C. J. Biol. Chem. 2001; 276: 11615-11623Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (592) Google Scholar). These events require Bax to undergo a conformational change leading to the exposure of cryptic epitopes at the N terminus of the molecule (10Goping I.S. Gross A. Lavoie J.N. Nguyen M. Jemmerson R. Roth K. Korsmeyer S.J. Shore G.C. J. Cell Biol. 1998; 143: 207-215Crossref PubMed Scopus (549) Google Scholar, 13Nechustan A. Smith C.L. Hsu Y.T. Youle R.J. EMBO J. 1999; 18: 2330-2341Crossref PubMed Scopus (627) Google Scholar, 14Desagher S. Osen-Sand A. Nichols A. Eskes R. Montessuit S. Lauper S. Maundrell K. Antonsson B. Martinou J.C. J. Cell Biol. 1999; 144: 891-901Crossref PubMed Scopus (1093) Google Scholar). Formation of the active conformation of Bax can be promoted by Bid, a BH3-only protein, present in its full-length inactive form in the cytosol. Bid is activated by proteolytic cleavage to generate a truncated molecule, tBid, resulting in the release of cytochrome c from mitochondria (14Desagher S. Osen-Sand A. Nichols A. Eskes R. Montessuit S. Lauper S. Maundrell K. Antonsson B. Martinou J.C. J. Cell Biol. 1999; 144: 891-901Crossref PubMed Scopus (1093) Google Scholar). Although tBid is also translocated from the cytosol to become an integral mitochondrial membrane protein, it can induce formation of the active Bax configuration in the cytosol by direct Bid/Bax interaction (15Eskes R. Desagher S. Antonsson B. Martinou J.C. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 929-935Crossref PubMed Scopus (1016) Google Scholar). There are also Bid-independent pathways of Bax insertion into the mitochondria as demonstrated by the use of Bid –/– mouse embryo fibroblasts treated with anti-TNFα (16Ruffolo S.C. Breckenridge D.G. Nguyen M. Goping I.S. Gross A. Korsmeyer S.J. Li H. Yuan J. Shore G.C. Cell Death Differ. 2000; 7: 1101-1108Crossref PubMed Scopus (109) Google Scholar). Bax translocation/membrane insertion and cell death may also occur following pH modifications (17Khaled A.R. Kim K. Hofmeister R. Muegge K. Durum S.K. Proc. Natl. Acad. Sci. 1999; 96: 14476-14481Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar, 18Tafani M. Cohn J.A. Karpinich N.O. Rothman R.J. Russo M.A. Farber J.L. J. Biol. Chem. 2002; 277: 49569-49576Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (117) Google Scholar), and enforced dimerization of Bax (11Gross A. Jockel J. Wei M.C. Korsmeyer S.J. EMBO J. 1998; 17: 3878-3885Crossref PubMed Scopus (966) Google Scholar). The aim of this study was to evaluate the extent of mitochondrial perturbation in activated T lymphocytes entering the caspase-independent phase of commitment to apoptosis, and to identify the upstream molecular effectors responsible. We found that Bax was indeed activated, and this led us to analyze the role of noncaspase proteases in this process. We focused in particular on lysosomal proteases, given that these proteases are able to substitute for caspases in a number of apoptotic models (reviewed in Refs. 19Johnson D.E. Leukemia. 2000; 14: 1695-1703Crossref PubMed Scopus (222) Google Scholar, 20Turk B. Stoka V. Rozman-Pungercar J. Cirman T. Droga-Mazovec G. Oreic K. Turk V. Biol. Chem. 2002; 383: 1035-1044Crossref PubMed Google Scholar, 21Mathiasen I.S. Jaattela M. Trends Mol. Med. 2002; 8: 212-220Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (147) Google Scholar). Pharmacological inhibition of cathepsins (Cat) and the use of small interfering RNA (siRNA)-mediated gene silencing (22McManus M.T. Sharp P.A. Nat. Rev. Genet. 2002; 3: 737-747Crossref PubMed Scopus (1215) Google Scholar) to target Cat D, Bax, and AIF mRNAs, demonstrated that Cat D, which is translocated from lysosomes to the cytosol upon apoptotic signaling, is the earliest event triggering a rapid change in Bax conformation together with insertion of this protein to the OMM. These events, which are independent of Bid cleavage/translocation, result in mild OMM permeabilization, the effects of which are limited to AIF release. AIF triggers in turn the early apoptotic phenotype induced by staurosporine (STS) in activated T lymphocytes. T Lymphocyte Isolation, Culture Conditions, and Cell Death Induction—Peripheral blood leukocytes were isolated from blood bank leukophoresis packs obtained from healthy volunteers (Etablissement Français du Sang). Adherent cells were removed by incubation on plastic dishes and passage over nylon wool columns. T lymphocytes were stimulated for 4 days with 2 μg/ml of the mitogenic GT2+T111 CD2 mAb pair kindly given by Dr. A. Bernard (U 343, Nice, France) plus 100 units/ml interleukin-2 (IL-2). Primary discontinuous density Percoll gradients (Amersham Biosciences) were used to isolate large activated T cells as previously described (1Dumont C. Durrbach A. Bidere N. Rouleau M. Kroemer G. Bernard G. Hirsch F. Charpentier B. Susin S.A. Senik A. Blood. 2000; 96: 1030-1038Crossref PubMed Google Scholar, 23Bidere N. Briet M. Durrbach A. Dumont C. Feldmann J. Charpentier B. de Saint-Basile G. Senik A. J. Biol. Chem. 2002; 277: 32339-32347Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (23) Google Scholar). These cells were exposed to 100–350 nm staurosporine (Sigma) for 90 min. Shrunken cells resulting from this treatment were isolated on a second density Percoll gradient. In some experiments, CD4+ and CD8+ T cells were separated prior to stimulation by immunomagnetic selection using anti-CD8 or anti-CD4-coated magnetic beads (Miltenyi Biotec, Auburn). To evaluate changes in inner mitochondrial transmembrane potential ΔΨm, cells were stained for 15 min at 37° with 40 nm of the potential sensitive fluorescent dye DiOC6 (3,3′-diethyloxacarbocyanine) from Molecular Probes (Interchim, Montluçon, France). Cells with complete ΔΨm loss were obtained by a-10 min incubation with 5 μm m-ClCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone, from Sigma). Condensed nuclei were examined after incubation of the cells for 5 min with 5 μm DAPI (Molecular Probes). Synthetic Inhibitors, Enzymatic Substrates, and Other Chemicals— The pan-caspase inhibitor, BAF (Boc-Asp(OMe)-fluoromethylketone), and the Cat B and L inhibitor, Z-FA-fmk (benzyloxycarbonyl-Phe-Ala-fluoromethylketone), were from Enzyme Systems Products. The Cat B inhibitor, CA-074-Me, was from Calbiochem (France Biochem, Meudon, France). The Cat D inhibitor, pepstatin A, the Cat B substrate, Z-Arg-Arg-βNA (z-RR-βNA), the Cat l substrate, Phe-Arg-βNA (FR-βNA), the Cat d substrate, hemoglobin, the β-hexosaminidase substrate, p-nitrophenyl N-acetyl-β-d-glucosaminide, and the inhibitor of vacuolar type H+-ATPase, bafilomycin A1, were from Sigma. Enzyme Assays—Cat B and Cat L were assayed by hydrolysis of their respective specific substrates z-RR-βNA and FR-βNA as described (24Barrett A.J. Kirschke H. Methods Enzymol. 1981; 80: 535-561Crossref PubMed Scopus (1729) Google Scholar). Cat D activity was determined as described by Barret and Kirschke (24Barrett A.J. Kirschke H. Methods Enzymol. 1981; 80: 535-561Crossref PubMed Scopus (1729) Google Scholar), with some modifications (25Kagedal K. Johansson U. Ollinger K. FASEB J. 2001; 15: 1592-1594Crossref PubMed Scopus (237) Google Scholar), by using hemoglobin as substrate. To measure Cat D activity in cytosolic fractions, cells were permeabilized with digitonin as described below. Hexosaminidase activity was assayed according to the protocol of Ref 26Stinchcombe J.C. Barral D.C. Mules E.H. Booth S. Hume A.N. Machesky L.M. Seabra M.C. Griffiths G.M. J. Cell Biol. 2001; 152: 825-834Crossref PubMed Scopus (327) Google Scholar. Immunofluorescence Studies—Cells were fixed with 3% paraformaldehyde in PBS for 30 min at 4 °C, washed 3 times with PBS. For the detection of the active form of Bax, they were permeabilized for 5 min with 0.0125% of the zwitterionic detergent CHAPS in PBS to avoid artificial activation of Bax (27Hsu Y.T. Youle R.J. J. Biol. Chem. 1998; 272: 10777-10783Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (444) Google Scholar). They were then incubated for 45 min with rabbit anti-Bax polyclonal antibodies raised against amino acids 1–21 of human Bax (Bax-NT, Upstate Biotechnology, Euromedex, Souffelweyersheim, France) together with goat anti-Hsp60 (N-20, Tebu, Le Perray-en-Yvelines, France) to localize mitochondria. The cells were then stained with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated AffiniPure goat anti-rabbit IgG and tetrarhodamine isothiocyanate (TRITC)-conjugated AffiniPure mouse anti-goat IgG from Jackson Immunoresearch Laboratories (Immunotech, Luminy-Marseille, France). For the detection of other molecules, cells were permeabilized with 0.05% Triton X-100 for 5 min at room temperature. We used a rabbit anti-AIF antiserum (kindly given by Dr. S. Susin, Institut Pasteur, France) together with a mouse anti-cytochrome c (6H2.B4, from BD Pharmingen, sold by Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France). The cells were then stained with FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG and TRITC-conjugated AffiniPure donkey anti-mouse IgG from Jackson Immunoresearch Laboratories. For Cat B, D, and L stains, we used an anti-human Cat B mAb (Ab-1, Oncogene Research Products, Calbiochem), a rabbit anti-human Cat D antiserum (Zymed Laboratories Inc., Stockholm, Sweden), and a rabbit anti-human Cat L antiserum (Athens Research and Technology, Athens, GA). The lysosomal-cytoplasmic pH gradient was monitored by incubating the cells for 1 min with 50 nm LysoTracker red (Molecular Probes). Lysosomal destabilization was estimated by using FITC-dextrans of different molecular weights from Sigma. In brief, cells were incubated with 5 mg/ml FITC-dextrans for 2 h at 37 °C. The cells were washed, chased with culture medium for 2 h, and then exposed to STS. The cells were examined by conventional or confocal fluorescence microscopy (Leica Microsystèmes, Rueil-Malmaison, France). Immunoblots—Preparation of cellular lysates were performed as described previously (23Bidere N. Briet M. Durrbach A. Dumont C. Feldmann J. Charpentier B. de Saint-Basile G. Senik A. J. Biol. Chem. 2002; 277: 32339-32347Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (23) Google Scholar). Briefly, 20 μg and 5 μg of cytosolic and mitochondrial extracts were separated on SDS-PAGE (12% polyacrylamide) and transferred onto a polyvinylidene difluoride membrane (Immobilon-P, Millipore, Bedford). Antibodies used in immunoblotting were as follow: rabbit antiserums against AIF (from Dr. Susin), EndoG (Apotech Corporation, Epalinges, Switzerland), Smac/DIABLO (Oncogene Research Products, Calbiochem), Bid (Cell Signaling Technology, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France), Bax (BD Pharmingen), and actin (Sigma); mouse mAb against Cat D (mAb 49, Transduction Laboratory, Becton Dickinson), cytochrome oxydase II (12C4, Molecular Probes), cytochrome c (7H8.2C12, BD Pharmingen), Bcl-2 (mAb 124, Dako, denmark), and goat polyclonal antibodies against Cat B (Santa Cruz Biotechnology). Immunoblots were developed using enhanced chemiluminescence reagents (ECL kit, Amersham Biosciences) after incubation with horseradish peroxidase-coupled secondary reagents from Amersham Biosciences. When necessary, the blots were stripped with a Western blot recycling kit (kit Chemicon, from Euromedex). Subcellular Fractionation—15 × 106 cells were washed twice in PBS and resuspended for 30 min at 4 °C in isotonic mitochondrial buffer (210 mm mannitol, 70 mm sucrose, 1 mm EDTA, and 10 mm Hepes, pH 7.5) supplemented with the protease inhibitor mixture "Complete" (Roche Applied Science). They were then subjected to 80 pestle strokes of a glass Dounce homogenizer (VWR, Strasbourg, France). Unbroken cells and nuclei were pelleted by centrifugation at 760 × g for 10 min at 4 °C. The resulting supernatants were centrifuged at 10,000 × g for 15 min to recover the heavy membrane pellets enriched for mitochondria and the S10 supernatants. The latter were centrifuged at 100,000 × g for1h at 4 °C to pellet the light membrane, and the resulting (S100) supernatants were stored as cytosolic fractions. The protein concentration in mitochondrial and cytosolic fractions was determined using the micro BCA kit (Pierce). For alkali extraction, the mitochondrial pellet was resuspended (0.25 mg/ml) in freshly prepared 0.1 m Na2CO3, pH 11.5, and incubated for 30 min on ice. The membranes were then pelleted in an airfuge (Beckman) operating 10 min at 30 psi. Cytosolic extracts free of lysosomes were prepared by a selective digitonin-based permeabilization technique according to Ref 28Foghsgaard L. Wissing D. Mauch D. Lademann U. Bastholm L. Boes M. Elling F. Leist M. Jaattela M. J. Cell Biol. 2001; 153: 999-1010Crossref PubMed Scopus (563) Google Scholar. In short, the cells were washed twice in PBS and incubated with extraction buffer (20 μg/ml digitonin, 250 mm sucrose, 20 mm Hepes, 10 mm KCl, 1.5 mm MgCl2, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, pH 7.5) supplemented with the mixture "Complete" for 5 min on ice. In these conditions, the cell membranes were permeabilized without lysosome integrity being affected as assayed by measuring hexosaminidase activity in the cytolytic fractions. siRNAs and T Lymphocyte Transfection—Silencing of cat D, bax, and aif gene expression in primary T lymphocytes was achieved by the siRNA technique that has recently been used to study gene function in mammalian cells (22McManus M.T. Sharp P.A. Nat. Rev. Genet. 2002; 3: 737-747Crossref PubMed Scopus (1215) Google Scholar, 29Elbashir S.M. Harborth J. Lendeckel W. Yalcin A. Weber K. Tuschl T. Nature. 2001; 411: 494-498Crossref PubMed Scopus (8162) Google Scholar). Duplexes of 21-nucleotide siRNA with two 3′-overhanging TT were synthesized by Proligo (Paris, France). The sense strand of the siRNA used to silence the Cat D gene (Cat D-siRNA) was GCUGGUGGACCAGAACAUC, corresponding to the position 666–684 relative to the start codon of the Cat D mRNA. The sense strand of the siRNA silencing bax gene corresponded to the position 384–402 (GGUGCCGGAACUGAUCAGA) relative to start codon of the Bax-α mRNA (Bax-siRNA). The Bax-siRNA sequence is present in six different Bax isoforms. The sense strand of the siRNA silencing aif gene (AIF-siRNA) was CUUGUUCCAGCGAUGGCAU (position 111–129 relative to start codon). Mock transfections were performed with buffer alone. An inefficient CD9 oligo (given by Dr. C. Boucheix, Inserm U268), corresponding to the GCCAUCCACUAUGCGUUGAAC sequence (position 334–354 relative to the start codon) was also used as a negative control of transfection (referred to as control-siRNA). Transfection of purified resting T cells was carried out by electroporation using the Nucleofection® system (Amaxa, Köln, Germany), according to the protocols proposed by the furnisher. Briefly, 4 × 106 T cells were resuspended in 100 μl of T cell nucleofector solution (Human T Cell Nucleofector kit) containing 75–150 pmol of double-stranded siRNAs. After electroporation, 400 μl of prewarmed cultured medium were added to the cuvette, and the cells were transferred into cultures plates containing prewarmed culture medium. After a 16 h rest, T cells were activated as described above, and the expression of the targeted genes was monitored by Western blot at different times. At the optimal time of gene silencing (usually 96-h post-transfection), apoptosis was induced by STS. Selective Mitochondrial Release of AIF during the Early Phase of Commitment to Apoptosis in Activated Primary T Lymphocytes—We have established an experimental system suitable for the isolation of a homogeneous population of activated T lymphocytes located in the early phase of commitment to apoptosis following a brief exposure to a low dose of STS (1Dumont C. Durrbach A. Bidere N. Rouleau M. Kroemer G. Bernard G. Hirsch F. Charpentier B. Susin S.A. Senik A. Blood. 2000; 96: 1030-1038Crossref PubMed Google Scholar). CD2- and IL-2-activated T cells, homogeneous in size, were first isolated as large cells in the low buoyant density fraction of discontinuous density Percoll gradients. These cells are referred to hereafter as control cells. Following exposure to 100 nm STS for 90 min, most of these cells (82 ± 7%, n = 5) displayed an increase in density and a decrease in volume (Fig. 1A, panel a). This made it possible to recover the shrunken cells on a second Percoll density gradient. As previously shown (1Dumont C. Durrbach A. Bidere N. Rouleau M. Kroemer G. Bernard G. Hirsch F. Charpentier B. Susin S.A. Senik A. Blood. 2000; 96: 1030-1038Crossref PubMed Google Scholar), most of these cells maintained a high ΔΨm (85–90% DIOC6high cells) but displayed peripheral chromatin condensation (panel b). They also displayed diffuse immunostaining of AIF, which spread into the cytoplasm and the nucleus, contrasting with the punctate immunostaining of cytochrome c seen on confocal (panel c) or conventional (panel d) microscopy. These changes occurred in the presence of BAF, a cell-permeable pan-caspase inhibitor, corroborating our previous observation that caspases are not involved at this stage (1Dumont C. Durrbach A. Bidere N. Rouleau M. Kroemer G. Bernard G. Hirsch F. Charpentier B. Susin S.A. Senik A. Blood. 2000; 96: 1030-1038Crossref PubMed Google Scholar). Like AIF and cytochrome c, the apoptogenic proteins Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, and endonuclease G (EndoG) reside in the intermembrane space of mitochondria, awaiting efflux in response to apoptotic stimuli (reviewed in Ref. 30van Loo G. Saelens X. van Gurp M. MacFarlane M. Martin S.J. Vandenabeele P. Cell Death Differ. 2002; 9: 1031-1042Crossref PubMed Scopus (530) Google Scholar, see also "Discussion"). Subcellular fractionation of the cells into P10 heavy membrane pellets (enriched in mitochondria) and cytosolic S100 fractions, followed by immunoblotting (Fig. 1, B and C), indicated that STS readily provoked the partial release of AIF from mitochondria into the cytosol but did not significantly induce the release of other apoptogenic factors from the mitochondria (Fig. 1B, lane b). In T lymphocytes at more advanced stages of apoptosis (lane c, exposure to 350 nm STS for 90 min, resulting in ≥30% ΔΨmlow cells), mitochondrial apoptogenic factors displayed a higher level of release into the cytosol (AIF and Omi/HtrA2) or even complete redistribution (cytochrome c, Smac/DIABLO, and EndoG). Thus, AIF was selectively translocated to the cytosol during the early phase of commitment to apoptosis in our system. Bid-independent Activation of Bax—Untreated and STS-treated cells were stained with rabbit antibodies directed against amino acids 1–21 of Bax (Bax-NT, green fluorescence) and examined by confocal microscopy, using an anti-Hsp60 antibody (red fluorescence) as a mitochondrial marker. No green fluorescence was detected in control cells whereas, after 90 min of STS treatment, such fluorescence was clearly visible and was almost completely co-localized with Hsp60-associated fluorescence (yellow staining, Fig. 2A). Conventional immunofluorescence microscopy showed that at least ≥70% of STS-treated T cells exhibited the Bax N terminus, irrespective of whether BAF was present. Bax conformational change occurred in both CD4+ and CD8+ T cells, to similar extents (Fig. 2, B and C). We further investigated the subcellular distribution of Bax by immunoblotting, after fractionation of the cells into cytosolic and heavy membrane fractions. Bax disappeared from the cytosol of STS-treated cells and was translocated to the mitochondria, with no change in molecular weight (Fig. 2D). Some of the Bax protein was integrated into the OMM, as shown by its resistance to alkaline extraction, like the transmembrane mitochondrial Bcl-2 protein (Fig. 2E). Note that in healthy control T lymphocytes, the Bax protein was not only found in the cytosol, but was also loosely associated with mitochondria. It was not actually integrated into the OMM, consistent with observations made in previous studies, in specific cell models (9Wolter K.G. Hsu Y.T. Smith C.L. Nechushtan A. Xi X.G. Youle R.J. J. Cell Biol. 1997; 139: 1281-1292Crossref PubMed Scopus (1577) Google Scholar, 14Desagher S. Osen-Sand A. Nichols A. Eskes R. Montessuit S. Lauper S. Maundrell K. Antonsson B. Martinou J.C. J. Cell Biol. 1999; 144: 891-901Crossref PubMed Scopus (1093) Google Scholar). Was Bid activated and tBid produced? Was it translocated to mitochondria at the same time as Bax? In cells treated with 100 nm STS, Bid remained entirely confined to the cytosol of STS-treated cells as a full-length p21 protein (Fig. 3A). In cells treated with 350 nm STS, p21 Bid was not proteolytically activated to generate p15 tBid, but was nonetheless relocated to the mitochondria (Fig. 3B). A recent study also showed that in HeLa cells treated with STS, only p21 Bid is translocated to the mitochondria, with very little p15 tBid generated (18Tafani M. Cohn J.A. Karpinich N.O. Rothman R.J. Russo M.A. Farber J.L. J. Biol. Chem. 2002; 277: 49569-49576Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (117) Google Scholar). In our hands, the appearance of tBid coincided with caspase activation at later stages of apoptosis (not shown). We conclude that during the early phase of commitment to apoptosis triggered by STS at a concentration of only 100 nm, Bid was not activated in our system, and therefore could not serve as a death ligand stimulating Bax immunoreactivity and relocation. Lysosomal Cathepsins B, D, and L Are Translocated to the Cytosol upon STS Apoptotic Signaling—Lysosomal cathepsins have been shown to be readily translocated to the cytosol and to mediate apoptosis in response to various stimuli (reviewed in Ref. 20Turk B. Stoka V. Rozman-Pungercar J. Cirman T. Droga-Mazovec G. Oreic K. Turk V. Biol. Chem. 2002; 383: 1035-1044Crossref PubMed Google Scholar). We therefore investigated the subcellular distribution of Cat B and L, both cysteine proteases, and of Cat D, an aspartic protease, all three of which are abundant in lysosomes. In control activated T cells, immunostaining of cathepsins B, D, and L displayed a punctate distribution on immunofluorescence microscopy, consistent with a lysosomal location. In contrast, in cells treated with STS for 90 min, these cathepsins displayed a mixed punctate/diffuse distribution, indicating that only part of them was translocated to the cytosol (Fig. 4A, see also the Western blot of Fig. 7A). No cathepsin was found in the nucleus, as assessed by confocal microscopy (not shown). The cytosol-lysosome pH gradient seemed to be preserved in STS-treated cells because LysoTracker-Red, an acidic organelle-specific probe, still accumulated in granular cellular structures. In contrast

Caspase-8, a proapoptotic protease, has an essential role in lymphocyte activation and protective immunity. We show that caspase-8 deficiency (CED) in humans and mice specifically abolishes activation of the transcription factor nuclear factor κB (NF-κB) after stimulation through antigen receptors, Fc receptors, or Toll-like receptor 4 in T, B, and natural killer cells. Caspase-8 also causes the αβ complex of the inhibitor of NF-κB kinase (IKK) to associate with the upstream Bcl10-MALT1 (mucosa-associated lymphatic tissue) adapter complex. Recruitment of the IKKα, β complex, its activation, and the nuclear translocation of NF-κB require enzyme activity of full-length caspase-8. These findings thus explain the paradoxical association of defective apoptosis and combined immunodeficiency in human CED.

NF-kappaB is a DNA-binding protein complex that transduces a variety of activating signals from the cytoplasm to specific sets of target genes. To understand the preferential recruitment of NF-kappaB to specific gene regulatory sites, we used NF-kappaB p65 in a tandem affinity purification and mass spectrometry proteomic screen. We identified ribosomal protein S3 (RPS3), a KH domain protein, as a non-Rel subunit of p65 homodimer and p65-p50 heterodimer DNA-binding complexes that synergistically enhances DNA binding. RPS3 knockdown impaired NF-kappaB-mediated transcription of selected p65 target genes but not nuclear shuttling or global protein translation. Rather, lymphocyte-activating stimuli caused nuclear translocation of RPS3, parallel to p65, to form part of NF-kappaB bound to specific regulatory sites in chromatin. Thus, RPS3 is an essential but previously unknown subunit of NF-kappaB involved in the regulation of key genes in rapid cellular activation responses. Our observations provide insight into how NF-kappaB selectively controls gene expression.

Abstract Controversial reports have suggested that SARS-CoV E and 3a proteins may be viroporins that conduct currents through the plasma membrane of the infected cells. If true, these proteins would represent accessible targets for the development of new antiviral drugs by using high-throughput patch-clamp techniques. Here we aimed at better characterizing the cell responses induced by E or 3a protein with a particular focus on the ion conductances measured at the cell surface. First, we show that expression of SARS-CoV-2 E or 3a protein in CHO cells gives rise to cells with newly-acquired round shape, tending to detach from the Petri dish. This suggests that cell death is induced upon expression of E or 3a protein. We confirmed this hypothesis by using flow cytometry, in agreement with earlier reports on other cell types. In adhering cells expressing E or 3a protein, whole-cell currents were in fact not different from the control condition indicating that E and 3a proteins are not plasma membrane viroporins. In contrast, recording currents on detached cells uncovered outwardly-rectifying currents, much larger than those observed in control. The current characteristics are reminiscent of what was previously observed in cells expressing SARS-CoV-1 E or 3a proteins. Herein, we illustrate for the first time that carbenoxolone blocks these outward currents suggesting that they are conducted by pannexin channels, mostly likely activated by cell morphology change and/or cell death. Alongside we also demonstrate that truncation of the C-terminal PDZ binding motifs reduces the proportion of dying cells but does not prevent pannexin currents suggesting distinct pathways for cell death and pannexin currents induced by E and 3a proteins. We conclude that SARS-CoV-2 E and 3a proteins are not acting as viroporins expressed at the plasma membrane. Author Summary A viroporin (or viral porin) is a class of proteins that is encoded by a virus genome. It is named porin because its biological role is to conduct ions through a pore that it created in a lipid membrane such as the one surrounding a human cell. if such viroporin is present at the external membrane of a human cell infected by a virus, it can be an easy target of an antiviral agent which thus does not have to enter the cell to be active. One example of viroporin is the flu M2 protein that is the target of amantadine, an antiviral agent used against flu. In previous studies, two proteins of SARS-CoV viruses, named E protein and 3a protein, have been suggested to be viroporins at the surface of infected human cells, potentially opening a new research avenue against SARS. Here we demonstrate that both proteins are not viroporins at the external membrane but they rather trigger changes in the cell shape and promote cell death. They only indirectly induce the activity of a porin that is encoded by the cell genome, named pannexin.

Abstract Glioblastoma is a devastating tumor of the central nervous system characterized by a poor survival and an extremely dark prognosis, making its diagnosis, treatment and monitoring highly challenging. Numerous studies have highlighted extracellular vesicles (EVs) as key players of tumor growth, invasiveness and resistance, as they carry and disseminate oncogenic material in the local tumor microenvironment and at distance. However, whether their quality and quantity reflect individual health status and changes in homeostasis is still not fully elucidated. Here, we separated EVs from plasma collected at different time points alongside with the clinical management of GBM patients. Our findings confirm that plasmatic EVs could be separated and characterized with standardized protocols, thereby ensuring the reliability of measuring vesiclemia, i.e . extracellular vesicle concentration in plasma. This unveils that vesiclemia is a dynamic parameter, which could be reflecting tumor burden and/or response to treatments. Further label-free liquid chromatography tandem mass spectrometry unmasks the von Willebrand Factor (VWF) as a selective protein hallmark for GBM-patient EVs. Our data thus support the notion that EVs from GBM patients showed differential protein cargos that can be further surveyed in circulating EVs, together with vesiclemia.

SUMMARY Centriolar satellites are high-order assemblies, scaffolded by the protein PCM1, that gravitate as particles around the centrosome and play pivotal roles in fundamental cellular processes notably ciliogenesis and autophagy. Despite stringent control mechanisms involving phosphorylation and ubiquitination, the landscape of post-translational modifications shaping these structures remains elusive. Here, we report that necrosulfonamide (NSA), a small molecule known for binding and inactivating the pivotal effector of cell death by necroptosis MLKL, intersects with centriolar satellites, ciliogenesis, and autophagy independently of MLKL. NSA functions as a potent redox cycler and triggers the oxidation and aggregation of PCM1 alongside select partners, while minimally impacting the overall distribution of centriolar satellites. Additionally, NSA-mediated ROS production disrupts ciliogenesis and leads to the accumulation of autophagy markers, partially alleviated by PCM1 deletion. Together, these results identify PCM1 as a redox sensor protein and provide new insights into the interplay between centriolar satellites and autophagy.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) are lipid-based nano-sized particles that convey biological material from donor to recipient cells. They play key roles in tumour progression, notably in glioblastoma in which the subpopulation of Glioblastoma Stem-like Cells (GSCs) might represent a meaningful source of tumour-derived EVs. However, the mechanisms involved in the production and release of EVs by GSCs are still poorly understood. Here, we report the identification of MLKL, a crucial effector of cell death by necroptosis, as a regulator of the constitutive secretion of small EVs from GSCs. The targeting of MLKL by genetic, protein depletion or chemical approaches alters endosomal trafficking and EV release and reduces GSC expansion in vitro . This function ascribed to MLKL appears independent of its role during necroptosis. In vivo , pharmacological inhibition of MLKL triggers a reduction of both the tumour burden in xenografted mice and of the level of plasmatic EVs. This work reinforces the idea of a non-deadly role for MLKL in endosomal trafficking and suggests that interfering with EV biogenesis is a promising therapeutic option to sensitize glioblastoma cells to death.

SUMMARY Glioblastoma stem-like cells (GSCs) compose a tumor-initiating and -propagating population, remarkably vulnerable to any variation in the stability and integrity of the endolysosomal compartment. Previous work showed that the expression and activity of the paracaspase MALT1 control GSC viability via lysosomal abundance. However, the underlying mechanisms remain elusive. By combining RNAseq with proteome-wide label-free quantification, we now report that MALT1 repression in patient-derived GSCs alters the cholesterol homeostasis, which aberrantly accumulates in lysosomes. This failure in cholesterol supply culminates in cell death and autophagy defects, which can be partially reverted by providing exogenous membrane-permeable cholesterol to GSCs. From a molecular standpoint, targeted lysosome proteome analysis unraveled that NPC lysosomal cholesterol transporters were exhausted when MALT1 was held in check. Accordingly, we found that hindering NPC1 and NPC2 phenocopies MALT1 inhibition. This supports the notion that GSC fitness relies on lysosomal cholesterol homeostasis.

Glioblastoma is one of the most lethal forms of adult cancer with a median survival of around 15 months. A potential treatment strategy involves targeting glioblastoma stem-like cells (GSC), which constitute a cell autonomous reservoir of aberrant cells able to initiate, maintain, and repopulate the tumor mass. Here, we report that the expression of the paracaspase mucosa-associated lymphoid tissue l (MALT1), a protease previously linked to antigen receptor-mediated NF-κB activation and B-cell lymphoma survival, inversely correlates with patient probability of survival. The knockdown of MALT1 largely impaired the expansion of patient-derived stem-like cells in vitro, and this could be recapitulated with pharmacological inhibitors, in vitro and in vivo. Blocking MALT1 protease activity increases the endo-lysosome abundance, impaired autophagic flux, and culminates in lysosomal-mediated death, concomitantly with mTOR inactivation and dispersion from lysosomes. These findings place MALT1 as a new druggable target involved in glioblastoma and unveil ways to modulate the homeostasis of endo-lysosomes.

The natural bioactive glycerophospholipid lysophosphatidic acid (LPA) binds to its cognate G protein-coupled receptors (GPCRs) on the cell surface to promote the activation of several transcription factors, including NF-κB. LPA-mediated activation of NF-κB relies on the formation of a signalosome that contains the scaffold CARMA3, the adaptor BCL10 and the paracaspase MALT1 (CBM complex). The CBM has been extensively studied in lymphocytes, where it links antigen receptors to NF-κB activation via the recruitment of the linear ubiquitin assembly complex (LUBAC), a tripartite complex of HOIP, HOIL1 and SHARPIN. Moreover, MALT1 cleaves the LUBAC subunit HOIL1 to further enhance NF-κB activation. However, the contribution of the LUBAC downstream of GPCRs has not been investigated. By using murine embryonic fibroblasts from mice deficient for HOIP, HOIL1 and SHARPIN, we report that the LUBAC is crucial for the activation of NF-κB in response to LPA. Further echoing the situation in lymphocytes, LPA unbridles the protease activity of MALT1, which cleaves HOIL1 at the Arginine 165. The expression of a MALT1-insensitive version of HOIL1 reveals that this processing is required for the optimal production of the NF-κB target cytokine interleukin-6. Lastly, we provide evidence that the guanine exchange factor GEF-H1 activated by LPA favors MALT1-mediated cleavage of HOIL1 and NF-κB signaling. Together, our results unveil a critical role for the LUBAC as a positive regulator of NF-κB signaling downstream of GPCRs.