The small heat shock proteins (sHsps) from human (Hsp27) and mouse (Hsp25) form large oligomers which can act as molecular chaperones in vitro and protect cells from heat shock and oxidative stress when overexpressed. In addition, mammalian sHsps are rapidly phosphorylated by MAPKAP kinase 2/3 at two or three serine residues in response to various extracellular stresses. Here we analyze the effect of sHsp phosphorylation on its quaternary structure, chaperone function, and protection against oxidative stress. We show that in vitro phosphorylation of recombinant sHsp as well as molecular mimicry of Hsp27 phosphorylation lead to a significant decrease of the oligomeric size. We demonstrate that both phosphorylated sHsps and the triple mutant Hsp27-S15D,S78D,S82D show significantly decreased abilities to act as molecular chaperones suppressing thermal denaturation and facilitating refolding of citrate synthase in vitro. In parallel, Hsp27 and its mutants were analyzed for their ability to confer resistance against oxidative stress when overexpressed in L929 and 13.S.1.24 cells. While wild type Hsp27 confers resistance, the triple mutant S15D,S78D,S82D cannot protect against oxidative stress effectively. These data indicate that large oligomers of sHsps are necessary for chaperone action and resistance against oxidative stress whereas phosphorylation down-regulates these activities by dissociation of sHsp complexes to tetramers. The small heat shock proteins (sHsps) from human (Hsp27) and mouse (Hsp25) form large oligomers which can act as molecular chaperones in vitro and protect cells from heat shock and oxidative stress when overexpressed. In addition, mammalian sHsps are rapidly phosphorylated by MAPKAP kinase 2/3 at two or three serine residues in response to various extracellular stresses. Here we analyze the effect of sHsp phosphorylation on its quaternary structure, chaperone function, and protection against oxidative stress. We show that in vitro phosphorylation of recombinant sHsp as well as molecular mimicry of Hsp27 phosphorylation lead to a significant decrease of the oligomeric size. We demonstrate that both phosphorylated sHsps and the triple mutant Hsp27-S15D,S78D,S82D show significantly decreased abilities to act as molecular chaperones suppressing thermal denaturation and facilitating refolding of citrate synthase in vitro. In parallel, Hsp27 and its mutants were analyzed for their ability to confer resistance against oxidative stress when overexpressed in L929 and 13.S.1.24 cells. While wild type Hsp27 confers resistance, the triple mutant S15D,S78D,S82D cannot protect against oxidative stress effectively. These data indicate that large oligomers of sHsps are necessary for chaperone action and resistance against oxidative stress whereas phosphorylation down-regulates these activities by dissociation of sHsp complexes to tetramers. small heat shock protein circular dichroism, CS, citrate synthase green fluorescent protein propidium iodide tumor necrosis factor mitogen-activated protein kinase Small heat shock proteins (sHsps)1 are constitutively expressed in virtually all organisms and exhibit a monomeric molecular mass of 15–42 kDa (for a recent review see Ref. 1Ehrnsperger M. Buchner J. Gaestel M. Fink A.L. Goto Y. Molecular Chaperones in the Life Cycle of Proteins. Marcel Dekker, New York1998: 533-575Google Scholar). Within the cell they can form oligomeric complexes of up to 1 MDa (2Arrigo A.P. Suhan J.P. Welch W.J. Mol. Cell. Biol. 1988; 8: 5059-5071Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar). Overexpression of different mammalian sHsps increases cellular thermoresistance to a significant degree (3Knauf U. Jakob U. Engel K. Buchner J. Gaestel M. EMBO J. 1994; 13: 54-60Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar, 4Landry J. Chretien P. Lambert H. Hickey E. Weber L.A. J. Cell Biol. 1989; 109: 7-15Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). sHsps can, furthermore, function in different, seemingly unrelated processes like RNA stabilization (5Nover L. Scharf K.D. Neumann D. Mol. Cell. Biol. 1983; 3: 1648-1655Crossref PubMed Scopus (220) Google Scholar), interaction with the cytoskeleton (6Miron T. Vancompernolle K. Vandekerckhove J. Wilchek M. Geiger B. J. Cell Biol. 1991; 114: 255-261Crossref PubMed Scopus (389) Google Scholar, 7Nicholl I.D. Quinlan R.A. EMBO J. 1994; 13: 945-953Crossref PubMed Scopus (396) Google Scholar), or apoptosis (8Arrigo A.-P. Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1998; 379: 19-26PubMed Google Scholar, 9Mehlen P. Schulze-Osthoff K. Arrigo A.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 16510-16514Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (582) Google Scholar). In vitro sHsps act as molecular chaperones preventing unfolded proteins from irreversible aggregation (10Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 10449-10453Crossref PubMed Scopus (1745) Google Scholar, 11Jakob U. Gaestel M. Engel K. Buchner J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 1517-1520Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 12Merck K.B. Groenen P.J. Voorter C.E. de Haard-Hoekman W.A. Horwitz J. Bloemendal H. de Jong W.W. J. Biol. Chem. 1993; 268: 1046-1052Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) and, in cooperation with other factors, e.g. Hsp70 and ATP, facilitating productive refolding of unfolded proteins (13Ehrnsperger M. Graber S. Gaestel M. Buchner J. EMBO J. 1997; 16: 221-229Crossref PubMed Scopus (634) Google Scholar, 14Lee G.J. Roseman A.M. Saibil H.R. Vierling E. EMBO J. 1997; 16: 659-671Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar). In mammalian cells certain sHsps, e.g. mouse Hsp25 or human Hsp27, form a converging element of the cellular stress response since they show both a stress-induced increase in expression and phosphorylation. Under heat shock conditions increased phosphorylation can be detected after several minutes while changes in expression are detected after several hours (15Landry J. Chretien P. Laszlo A. Lambert H. J. Cell. Physiol. 1991; 147: 93-101Crossref PubMed Scopus (125) Google Scholar). The rapid stress-induced phosphorylation is the result of stimulation of the p38 MAP kinase cascade and subsequent activation of MAPKAP kinases 2 and 3 which directly phosphorylate mammalian sHsps (16Stokoe D. Engel K. Campbell D.G. Cohen P. Gaestel M. FEBS Lett. 1992; 313: 307-313Crossref PubMed Scopus (472) Google Scholar, 17Ludwig S. Engel K. Hoffmeyer A. Sithanandam G. Neufeld B. Palm D. Gaestel M. Rapp U.R. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 6687-6697Crossref PubMed Scopus (154) Google Scholar) at several distinct sites (18Gaestel M. Schroder W. Benndorf R. Lippmann C. Buchner K. Hucho F. Erdmann V.A. Bielka H. J. Biol. Chem. 1991; 266: 14721-14724Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 19Landry J. Lambert H. Zhou M. Lavoie J.N. Hickey E. Weber L.A. Anderson C.W. J. Biol. Chem. 1992; 267: 794-803Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Since sHsp phosphorylation and stress-induced expression show different kinetics, it is assumed that phosphorylation of the pre-existing constitutively expressed sHsps is a first phase of the stress response while the elevated expression at a time when their phosphorylation is already down-regulated comprises the second phase. So far, it is not clear whether sHsps fulfill different cellular functions at these different stages of the stress response. In contrast to plant sHsps, which are not phosphorylated and structurally reorganized in response to stress (20Suzuki T.C. Krawitz D.C. Vierling E. Plant Physiol. 1998; 116: 1151-1161Crossref PubMed Scopus (42) Google Scholar), increased phosphorylation of mammalian sHsps leads to changes in the oligomeric organization resulting in both smaller (21Kato K. Hasegawa K. Goto S. Inaguma Y. J. Biol. Chem. 1994; 269: 11274-11278Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 22Lavoie J.N. Lambert H. Hickey E. Weber L.A. Landry J. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 505-516Crossref PubMed Scopus (570) Google Scholar, 23Zantema A. Verlaand-De Vries M. Maasdam D. Bol S. van der Eb A. J. Biol. Chem. 1992; 267: 12936-12941Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) and larger oligomers (24Arata S. Hamaguchi S. Nose K. J. Cell. Physiol. 1997; 170: 19-26Crossref PubMed Scopus (15) Google Scholar, 25Mehlen P. Mehlen A. Guillet D. Preville X. Arrigo A.P. J. Cell. Biochem. 1995; 58: 248-259Crossref PubMed Scopus (100) Google Scholar). In cells exposed to TNFα a transient formation of large oligomers was followed by the accumulation of small oligomers (25Mehlen P. Mehlen A. Guillet D. Preville X. Arrigo A.P. J. Cell. Biochem. 1995; 58: 248-259Crossref PubMed Scopus (100) Google Scholar, 26Mehlen P. Hickey E. Weber L.A. Arrigo A.P. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997; 241: 187-192Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar). It is supposed that small oligomers and especially monomers are responsible for stabilization of the actin filaments (27Benndorf R. Hayess K. Ryazantsev S. Wieske M. Behlke J. Lutsch G. J. Biol. Chem. 1994; 269: 20780-20784Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 28Lavoie J.N. Gingras-Breton G. Tanguay R.M. Landry J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 3420-3429Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 29Lavoie J.N. Hickey E. Weber L.A. Landry J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 24210-24214Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) and that the large oligomers induce a protection against stress (13Ehrnsperger M. Graber S. Gaestel M. Buchner J. EMBO J. 1997; 16: 221-229Crossref PubMed Scopus (634) Google Scholar, 14Lee G.J. Roseman A.M. Saibil H.R. Vierling E. EMBO J. 1997; 16: 659-671Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar, 26Mehlen P. Hickey E. Weber L.A. Arrigo A.P. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997; 241: 187-192Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar,30Preville X. Schultz H. Knauf U. Gaestel M. Arrigo A.P. J. Cell. Biochem. 1998; 69: 436-452Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar). So far, the influence of the quaternary structure of mammalian sHsps on their chaperone activity has not been characterized. Hence, although some aspects of sHsp function already have become clear, a comprehensive picture of their function is still lacking. In this study, we phosphorylated sHsps by MAPKAP kinase 2 to investigate the influence on their oligomerization and chaperone properties in vitro. In a second approach, we used “molecular mimicry” of serine phosphorylation of Hsp27 to study the effect of phosphorylation also in vivo. To this end phosphorylatable serines were replaced by negatively charged aspartate residues with similar overall structure. This strategy has been used before to obtain information about the structure and function of phosphorylated isoforms of a wide variety of proteins, such as isocitrate dehydrogenase (31Thorsness P.E. Koshland Jr., D.E. J. Biol. Chem. 1987; 262: 10422-19425Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), serum response factor (32Manak J.R. Prywes R. Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 3652-3659Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar), myosin heavy chain (33Egelhoff T.T. Lee R.J. Spudich J.A. Cell. 1993; 75: 363-371Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (242) Google Scholar), MAPK kinase 1 (34Cowley S. Paterson H. Kemp P. Marshall C.J. Cell. 1994; 77: 841-852Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1853) Google Scholar, 35Mansour S.J. Matten W.T. Hermann A.S. Candia J.M. Rong S. Fukasawa K. Vande-Woude G.F. Ahn N.G. Science. 1994; 265: 966-970Crossref PubMed Scopus (1260) Google Scholar), vesicular stomatitis virus phosphoprotein P (36Gao Y. Lenard J. EMBO J. 1995; 14: 1240-1247Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar), and multidrug resistance glycoprotein (37Hardy S.P. Goodfellow H.R. Valverde M.A. Gill D.R. Sepulveda V. Higgins C.F. EMBO J. 1995; 14: 68-75Crossref PubMed Scopus (196) Google Scholar). For Hsp27 we constructed three different mutants replacing one (S15D), two (S78D,S82D), or all three (S15D,S78D,S82D) phosphorylation sites by aspartate. These mutants were compared in their oligomerization and chaperone properties with the phosphorylated protein. Furthermore, overexpression of these mutants was used to analyze the dependence of the protective function of Hsp27 on oligomerization. Size exclusion liquid chromatography was carried out on a Superose 6 HR 30/10 column (Pharmacia) equilibrated with 30 mm NH4Cl, 20 mm Tris-HCl, pH 7.6, 10 mm MgCl2, 0.5 mm dithioerythritol, 50 μmNaN3, and 2 μm phenylmethylsulfonyl fluoride. For estimation of the molecular mass a combination of several proteins of the LMW and HMW calibration kit (Pharmacia) were used (thyroglobulin, 669 kDa; ferritin, 440 kDa; catalase 232 kDa; aldolase, 158 kDa; and chymotrypsinogen A, 25 kDa). 200 pmol of recombinant Hsp25 or Hsp27 were incubated with 17 pmol of recombinant GST-MAPKAP kinase 2 Δ3BΔPC or 60 milliunits of native purified MAPKAP kinase 2 (Upstate Biotechnology), 10 nmol of ATP, and 3 pmol of [γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol) in a reaction volume of 50 μl containing 50 mmα-glycerophosphate, pH 7.4, 0.1 mm EDTA, and 4 mm magnesium acetate at 30 °C for 3 h. Before and after the incubation aliquots of 10 μl were taken and proteins were precipitated with 1 ml of 5% trichloroacetic acid. The pellets were washed twice with 20% trichloroacetic acid. Pellets were measured in a scintillation counter in order to calculate the relative incorporation of phosphate. Mutagenesis of pAK3038-Hsp27 (11Jakob U. Gaestel M. Engel K. Buchner J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 1517-1520Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) was performed using the TransformerTM Site-directed Mutagenesis Kit (CLONTECH) and the oligonucleotides 5′-GCGCTCGACCGGCAACTCGACAGCGGGG-3′ changing the codons for both serine 78 and 82 to aspartate and 5′-CTTCCTTTTTCGATATCATTGAAGCATTT-3′ for selection of positive clones by changing the restriction siteSspI to EcoRV. The resulting plasmid was pAK3038-Hsp27-S78D,S82D. For the mutagenesis of serine 15 to aspartate we used the Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit (Stratagene) and the two corresponding oligonucleotides 5′-GGGGCCCCGACTGGGACCCC-3′and 5′-GGAAGGGGTCCCAGTCGGGGCCCCGCAGG-3′ leading to plasmid pAK3038-Hsp27-S15D. pAK3038-Hsp27-S15D,S78D,S82D was constructed by inserting the NdeI/KpnI fragment of pAK3038-Hsp27-S15D into NdeI/KpnI cut pAK3038-Hsp27-S78D,S82D. All mutations were verified by sequencing. Near and far UV circular dichroism (CD) spectra were recorded using a Jasco J715 spectropolarimeter. Hsp27 and its mutants were dialyzed overnight against 10 mm potassium phosphate, pH 7.0. After centrifugation of the samples to remove aggregates the protein concentrations were determined. Near UV spectra were recorded at 245–330 nm in thermostated 0.5-cm quarz cuvettes at 20 °C. The far UV spectra were recorded at the same temperature at 200–250 nm in 0.1-cm quartz cuvettes. As a control for unstructured protein, Hsp27 was incubated in 6 m guanidinium chloride in potassium phosphate buffer, pH 7.2, for 4 h at 20 °C. The protein was then treated and measured like the native samples. All spectra were buffer corrected and 12 times accumulated. Mean residue ellipticities for the spectra were calculated based on a mean residue molecular weight of 112. Electron microscopic investigations were performed with negatively stained protein samples. Negative staining was done at a protein concentration of 0.1 mg/ml with 1% uranyl formiate using the double-carbon film technique (38Behlke J. Lutsch G. Gaestel M. Bielka H. FEBS Lett. 1991; 288: 119-122Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). Electron micrographs were taken with a Philips EM400T at 80 kV and a magnification of × 60,000. For statistical evaluation selected micrographs were digitized using a linear-CCD densitometer (EMiL, Image Science GmbH, Berlin, Germany) with a sampling size corresponding to 1 nm at the specimen scale. Analysis was done with the analySIS software (Soft Imaging System GmbH, Münster, Germany). Briefly, micrographs were shading corrected, median filtered, and binerized using an adequate threshold to eliminate background staining. Particles were separated using a watershed algorithm, and detected and classified according to their area size. Thermal aggregation of CS and oxaloacetic acid-induced reactivation of CS were performed as described in Ref. 13Ehrnsperger M. Graber S. Gaestel M. Buchner J. EMBO J. 1997; 16: 221-229Crossref PubMed Scopus (634) Google Scholar in the presence and absence of phosphorylated and nonphosphorylated Hsp27 and its mutants. IgG was used as a control for unspecific protein effects. The experiments were performed in 20 mm sodium phosphate buffer, pH 7.0, 100 mm NaCl in a volume of 120 μl in quartz microcuvettes (path length: 1 cm). Insulin was added to a final concentration of 45 μm (0.25 mg/ml) to the buffer in the presence and absence of phosphorylated or nonphosphorylated Hsp27. The reaction was started by 1:25 dilution of dithiothreitol to a final concentration of 20 mm (stock solution: 0.5 m in assay buffer). Turbidity due to the aggregation of the insulin B chain was then monitored at 30 °C and 400 nm in a UV-Vis spectrophotometer equipped with a temperature control unit. All Hsp27 concentrations refer to a 16-subunit oligomeric complex. The pcDNA3 vector (Invitrogen) carrying the cytomegalovirus promoter was used to drive eukaryotic expression of Hsp27 and its mutants. At the amino-terminal end of Hsp27 a HA-tag (MAYPYDVPPYASLGGH) was added during re-cloning from pAK3038 vectors. Exponentially growing L929 cells in Dulbecco's modified Eagle's medium (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) supplemented with 5% fetal calf serum (Life Technologies, Inc.) were plated at a density of 106 cells/78 cm2 and allowed to grow in a 5% CO2 atmosphere at 37 °C 24 h prior to transfection. Cells were transfected with 5 μg of DNA (either pcDNA3 plain vector or pcDNA3-Hsp27-WT, -S15D, -S78D,S82D, or -S15,S78D,S82D) using DAC30 (Eurogentec, Angers, France). Before transfection, serum was removed from the cell culture. DNA and DAC 30 at a ratio of 1:2 (w:v), respectively, were separately diluted in 600 μl of 150 mm NaCl. The different DNA solutions were then added to their corresponding DAC30 solutions and incubated 20 min at room temperature. The different mixes were subsequently added to the cells and incubated 3 h in normal culture conditions before supplementing the culture media with 10% fetal calf serum. The efficiency of transfection was estimated in parallel experiments using pSVβ plasmid that contains the gene encoding β-galactosidase under the control of the SV40 promoter (CLONTECH, Palo Alto, CA). Cells expressing β-galactosidase were monitored by 5-bromochloro-3-indolyl-β-d-galactosidase staining (39Lim K. Chae C. BioTechniques. 1989; 7: 576-579Crossref PubMed Scopus (12) Google Scholar). Transfection efficiency was determined to range at 20 ± 3%. Expression of the different proteins was monitored by immunoblot analysis using a specific polyclonal antibody directed against human Hsp27 as described previously (40Mehlen P. Preville X. Chareyron P. Briolay J. Klemenz R. Arrigo A.P. J. Immunol. 1995; 154: 363-374PubMed Google Scholar). 24 h after transfection, cells were plated at a density of 104 cells per well in 96-well plates (Nunc, Rockskilde, Denmark) and were grown 24 h before being analyzed for their resistance to TNFα or H2O2. Two-fold serial dilutions of TNFα or H2O2 were added to the cells. Actinomycin D (0.5 μg/ml) was used to enhance the killing activity of TNFα. Incubations were 24 h with TNFα or 16 h with H2O2. Survival was measured with alamarBlueTM (Interchim, Montluçon, France) which is a metabolic indicator that yields a fluorescent signal in response to metabolic activity. Briefly, alamarBlueTM was added to the cells at a 5% final volume and incubated 3 h at 37 °C. The fluorescence of each well was read with an excitation wavelength of 560 nm and an emission wavelength of 590 nm using a VictorTMfluorometer (Wallac, Turku, Finland). Crystal violet staining (40Mehlen P. Preville X. Chareyron P. Briolay J. Klemenz R. Arrigo A.P. J. Immunol. 1995; 154: 363-374PubMed Google Scholar) was selected for the determination of the survival rates in the hydrogen peroxide set of experiments because of the unreliability of the alamarBlueTM assay due to interference with H2O2. The percentage of cell survival was defined as the relative absorbance of sample versusuntreated control cells. Immortalized rat neuroblasts 13.S.1.24 have been described previously (41Coronas V. Feron F. Hen R. Sicard G. Jourdan F. Moyse E. J. Neurochem. 1997; 69: 1870-1881Crossref PubMed Scopus (56) Google Scholar). They were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum (Life Technologies, Inc.) and 0.3 mg/ml gentamycin (Life Technologies, Inc.). Exponentially growing 13.S.1.24 cells were plated at a density of 5 × 103cells/cm2 and allowed to grow at 37 °C for 24 h prior transfection. Cells were transfected using Fugen-6 reagent (Roche Molecular Biochemicals) according to the manufacturers instructions with 2.34 μg of pcDNA3, pcDNA3-Hsp27-WT, -S15D, -S78D,S82D, or -S15D,S78,82D vector together with 0.26 μg of the green fluorescent protein expressing vector pEGFP-C1 (CLONTECH, Palo Alto, CA). 24 h after transfection, cells were plated at a density of 5 × 103 cells/cm2 and were further grown for 24 h before their resistance to cytotoxicity induced by the free radical inducer menadione (Sigma Chimie, Saint-Quentin, Fallavier, France) was analyzed. After 24 h of incubation in the presence of 10 μm menadione, cells were harvested by trypsination, resuspended in phosphate-buffered saline, and incubated with 1 mg/ml propidium iodide (PI). After 10 min of incubation at room temperature, cell fluorescence was recorded by flow cytometric analysis using a FACScan cytometer (Beckton Dickinson, Le Pont de Claix, France) equipped with FL1 and FL3 detectors. Excitation: 488 nm, emission filters 530 nm for GFP and 630 nm for PI. To study the influence of Hsp27 phosphorylation on its oligomeric structure, recombinant Hsp27 (11Jakob U. Gaestel M. Engel K. Buchner J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 1517-1520Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) was phosphorylated by MAPKAP kinase 2 (16Stokoe D. Engel K. Campbell D.G. Cohen P. Gaestel M. FEBS Lett. 1992; 313: 307-313Crossref PubMed Scopus (472) Google Scholar) in vitro. The oligomeric size of differently phosphorylated Hsp27 was analyzed by size exclusion liquid chromatography using Superose 6. As determined by a number of different methods (12Merck K.B. Groenen P.J. Voorter C.E. de Haard-Hoekman W.A. Horwitz J. Bloemendal H. de Jong W.W. J. Biol. Chem. 1993; 268: 1046-1052Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 13Ehrnsperger M. Graber S. Gaestel M. Buchner J. EMBO J. 1997; 16: 221-229Crossref PubMed Scopus (634) Google Scholar, 23Zantema A. Verlaand-De Vries M. Maasdam D. Bol S. van der Eb A. J. Biol. Chem. 1992; 267: 12936-12941Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 38Behlke J. Lutsch G. Gaestel M. Bielka H. FEBS Lett. 1991; 288: 119-122Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar, 42Arrigo A.P. Welch W.J. J. Biol. Chem. 1987; 262: 15359-15369Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 43Chiesa R. McDermott M.J. Mann E. Spector A. FEBS Lett. 1990; 268: 222-226Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar, 44Lee G.J. Pokala N. Vierling E. J. Biol. Chem. 1995; 270: 10432-10438Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (272) Google Scholar, 45Farahbakhsh Z.T. Huang Q.L. Ding L.L. Altenbach C. Steinhoff H.J. Horwitz J. Hubbell W.L. Biochemistry. 1995; 34: 509-516Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar, 46Sanger F. J. Biol. Chem. 1949; 45: 563-574Google Scholar), nonphosphorylated sHsps form complexes of an average molecular mass of 200–800 kDa indicating a complex of 12 to nearly 40 sHsp monomers. Our analysis shows that nonphosphorylated Hsp27 exhibits an average mass of 530 kDa which correlates with an oligomer of about 24 subunits (Fig.1 A). In human glioma cells (21Kato K. Hasegawa K. Goto S. Inaguma Y. J. Biol. Chem. 1994; 269: 11274-11278Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) and in transfected hamster cells (22Lavoie J.N. Lambert H. Hickey E. Weber L.A. Landry J. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 505-516Crossref PubMed Scopus (570) Google Scholar) induction of Hsp27 phosphorylation has been shown to lead to the reduction of the oligomeric size to about 70–250 kDa. In our analysis phosphorylated Hsp27 (0.6 mol of phosphate incorporated per mol of Hsp27 monomer, about 65% of the phosphate was covalently bound to Ser-82, 22% to Ser-78, and 13% to Ser-15 (16Stokoe D. Engel K. Campbell D.G. Cohen P. Gaestel M. FEBS Lett. 1992; 313: 307-313Crossref PubMed Scopus (472) Google Scholar)) shows only traces of the large oligomer, and predominantly a peak corresponding to a molecular mass of about 110 kDa indicative of a Hsp27 tetramer (Fig. 1 A). Since these data were in contrast to former results for the murine homolog Hsp25, where no influence of phosphorylation on the oligomerization, as judged by gel filtration, could be detected (3Knauf U. Jakob U. Engel K. Buchner J. Gaestel M. EMBO J. 1994; 13: 54-60Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar), we repeated the experiments for Hsp25 under the same conditions as shown above. Interestingly, even before phosphorylation, a significant amount of Hsp25 forms small oligomers. In addition, as a result of phosphorylation by MAPKAP kinase 2 (1.6 mol of phosphate/mol of protein, where 55% of the phosphate was covalently bound to Ser-86 and 45% to Ser-15, (16Stokoe D. Engel K. Campbell D.G. Cohen P. Gaestel M. FEBS Lett. 1992; 313: 307-313Crossref PubMed Scopus (472) Google Scholar)) we detected a significant shift to small Hsp25 oligomers (Fig. 1 B) similar to the results obtained for Hsp27. The phosphorylation dependence of Hsp27 oligomerization was further characterized by subsequently mixing the phosphorylated Hsp27 with different amounts of the nonphosphorylated protein. After an incubation of 60 min at 25 °C allowing the exchange of subunits between the different oligomers the samples were analyzed by gel filtration (Fig.1 C, mixing of equimolar amounts of nonphosphorylated and phosphorylated, 0.6 mol of phosphate/mol of protein, Hsp27). The amounts of tetramers and larger oligomers were determined as a function of Hsp27 phosphorylation (Fig. 1 D). The dissociation of the large oligomers and the formation of tetramers depends on the degree of phosphorylation with a midpoint of transition being reached at a phosphorylation level of about 0.3 mol of phosphate/mol of Hsp27 monomer and complete tetramer formation occurs above 0.6 mol of phosphate/mol of Hsp27. Since the mixing experiment leads to different oligomers and since 32P-labeled phosphorylated Hsp27 could be detected to a lower degree also in the large complexes (Fig.1 C), it is supposed that the oligomerization process is reversible and that the equilibrium is regulated by phosphorylation.

We demonstrate that lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor (TNF) biosynthesis becomes independent of MAPKAP kinase 2 (MK2) when the AU-rich element (ARE) of the TNF gene is deleted. In spleen cells and macrophages where TNF biosynthesis is restored as a result of this deletion, interleukin (IL)-6 biosynthesis is still dependent on MK2. In MK2-deficient macrophages the half-life of IL-6 mRNA is reduced more than 10-fold, whereas the half-life of TNF mRNA is only weakly decreased. It is shown that the stability of a reporter mRNA carrying the AU-rich 3′-untranslated region (3′-UTR) of IL-6 is increased by MK2. The data provide in vivo evidence that the AU-rich 3′-UTRs of TNF and IL-6 are downstream to MK2 signaling and make MK2 an essential component of mechanisms that regulate biosynthesis of IL-6 at the levels of mRNA stability, and of TNF mainly through TNF-ARE-dependent translational control. We demonstrate that lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor (TNF) biosynthesis becomes independent of MAPKAP kinase 2 (MK2) when the AU-rich element (ARE) of the TNF gene is deleted. In spleen cells and macrophages where TNF biosynthesis is restored as a result of this deletion, interleukin (IL)-6 biosynthesis is still dependent on MK2. In MK2-deficient macrophages the half-life of IL-6 mRNA is reduced more than 10-fold, whereas the half-life of TNF mRNA is only weakly decreased. It is shown that the stability of a reporter mRNA carrying the AU-rich 3′-untranslated region (3′-UTR) of IL-6 is increased by MK2. The data provide in vivo evidence that the AU-rich 3′-UTRs of TNF and IL-6 are downstream to MK2 signaling and make MK2 an essential component of mechanisms that regulate biosynthesis of IL-6 at the levels of mRNA stability, and of TNF mainly through TNF-ARE-dependent translational control. mitogen-activated protein kinase stress-activated protein kinase interleukin tumor necrosis factor lipopolysaccharide interferon untranslated region AU-rich element enzyme-linked immunosorbent assay total exudate peritoneal macrophage nucleotide(s) tristetraprolin The role of the stress-activated p38 MAPK/SAPK21 protein kinase cascade (reviewed in Ref. 1Ono K. Han J. Cell. Signal. 2000; 12: 1-13Crossref PubMed Scopus (1402) Google Scholar) in inflammation has been defined several years ago by the anti-inflammatory effect of the p38 MAPKα,β/SAPK2a,b inhibitor SB203580 and related compounds (reviewed in Ref. 2Lee J.C. Kassis S. Kumar S. Badger A. Adams J.L. Pharmacol. Ther. 1999; 82: 389-397Crossref PubMed Scopus (334) Google Scholar). Accordingly, it was expected that several components of this kinase cascade may be essential components for early signaling in the inflammatory response and, hence, targets for an anti-inflammatory therapy. Targeted disruption of p38 MAPKα/SAPK2a in mice results in embryonic lethality and impaired IL-1 signaling in differentiated embryonic stem cells in one study (3Allen M. Svensson L. Roach M. Hambor J. McNeish J. Gabel C.A. J. Exp. Med. 2000; 191: 859-870Crossref PubMed Scopus (252) Google Scholar) and in defective erythropoietin expression in a second study (22Tamura K. Sudo T. Senftleben U. Dadak A.M. Johnson R. Karin M. Cell. 2000; 102: 221-231Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (321) Google Scholar). Deletion of one of the two known specific upstream activators of p38 MAPK/SAPK2, the dual-specific MAPK kinase MKK3, leads to a reduction in IL-12 production (4Lu H.T. Yang D.D. Wysk M. Gatti E. Mellman I. Davis R.J. Flavell R.A. EMBO J. 1999; 18: 1845-1857Crossref PubMed Scopus (328) Google Scholar) and impaired tumor necrosis factor (TNF)-induced cytokine expression (5Wysk M. Yang D.D. Lu H.T. Flavell R.A. Davis R.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 3763-3768Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar). Interestingly, mice lacking one of the several kinases downstream to p38 MAPK/SAPK2, the serine/threonine kinase MK2 (also designated as MAPK-activated protein (MAPKAP) kinase 2), show a reduction of the bacterial lipopolysaccharide (LPS)-induced biosynthesis of TNF-α, interferon (IFN)-γ, IL-1, IL-6, and nitric oxide resembling the effect of SB203580 at least in part (6Kotlyarov A. Neininger A. Schubert C. Eckert R. Birchmeier C. Volk H.D. Gaestel M. Nat. Cell Biol. 1999; 1: 94-97Crossref PubMed Scopus (687) Google Scholar). The different phenotypes of the mice mutated in components of the p38 MAPK/SAPK2 cascade analyzed so far demonstrate the complexity of this signaling module, which is far away from being a linear step by step reaction (cf. Ref.1Ono K. Han J. Cell. Signal. 2000; 12: 1-13Crossref PubMed Scopus (1402) Google Scholar). In the last few years it became evident that the 3′-untranslated region (UTR) of mRNA contributes to regulation of gene expression by influencing subcellular localization of mRNA, its translation or degradation (reviewed in Ref. 7Conne B. Stutz A. Vassalli J.D. Nat. Med. 2000; 6: 637-641Crossref PubMed Scopus (467) Google Scholar). AU-rich elements (AREs) in the 3′-UTR have been identified as cis-elements that affect mRNA stability (8Shaw G. Kamen R. Cell. 1986; 46: 659-667Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (3124) Google Scholar, 9Chen C.Y. Shyu A.B. Trends Biochem. Sci. 1995; 20: 465-470Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1688) Google Scholar) and translation (10Han J. Brown T. Beutler B. J. Exp. Med. 1990; 171: 465-475Crossref PubMed Scopus (431) Google Scholar). Recently, it has been shown that the p38 MAPK/SAPK2 cascade is involved in regulating mRNA stability via 3′-UTRs of IL-8, IL-6, c-Fos, GM-CSF mRNAs (11Winzen R. Kracht M. Ritter B. Wilhelm A. Xu N. Shyu A.B. Müller M. Gaestel M. Resch K. Holtmann H. EMBO J. 1999; 18: 4969-4980Crossref PubMed Scopus (713) Google Scholar), via the 3′-UTR of cyclooxygenase 2 mRNA (12Lasa M. Mahtani K.R. Finch A. Brewer G. Saklatvala J. Clark A.R. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 4265-4274Crossref PubMed Scopus (370) Google Scholar), via the 3′-UTR of vascular endothelial growth factor mRNA (13Pages G. Berra E. Milanini J. Levy A.P. Pouyssegur J. J. Biol. Chem. 2000; 275: 26484-26491Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (160) Google Scholar), and also via the 3′-UTR of TNF mRNA (14Brook M. Sully G. Clark A.R. Saklatvala J. FEBS Lett. 2000; 483: 57-61Crossref PubMed Scopus (193) Google Scholar). Furthermore, a significant p38 MAPK/SAPK2-dependent contribution to translational control of the ARE in the 3′-UTR of TNF mRNA has also been demonstrated (15Kontoyiannis D. Pasparakis M. Pizarro T.T. Cominelli F. Kollias G. Immunity. 1999; 10: 387-398Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1109) Google Scholar, 23Mijatovic T. Houzet L. Defrance P. Droogmans L. Huez G. Kruys V. Eur. J. Biochem. 2000; 267: 6004-6012Crossref PubMed Scopus (40) Google Scholar). In the case of 3′-UTR-dependent stability of IL-8 mRNA, a role for the kinase MK2 downstream to p38 MAPK/SAPK2 was evident, since mutants of MK2 interfered with IL-8 mRNA stability (11Winzen R. Kracht M. Ritter B. Wilhelm A. Xu N. Shyu A.B. Müller M. Gaestel M. Resch K. Holtmann H. EMBO J. 1999; 18: 4969-4980Crossref PubMed Scopus (713) Google Scholar). For the mice lacking MK2 it was not clear whether the relatively complex phenotype resulted from secondary effects of the reduced TNF level after LPS induction or whether MK2 is involved in regulation of the different cytokines in response to LPS in parallel. In this paper, we present evidence that deletion of the ARE in the 3′-UTR of the TNF gene restored LPS-induced TNF production in MK2-deficient mice and could even increase TNF production above the wild type level. We analyzed the effect of lacking MK2 on IL-6 biosynthesis in mice where the TNF production was restored and found that IL-6 biosynthesis is still impaired. From the data obtained, a parallel ARE-dependent regulation of TNF and IL-6 biosynthesis by MK2 is proposed. The MK2−/− and TNFΔARE/− mice used for the crossing were on a mixed 129Sv × C57BL/6 background. Genotyping for MK2 was carried out using a three-primer PCR with the oligonucleotides 5′-cgtgggggtggggtgacatgctggttgac (5′-MK2), 5′-ggtgtcaccttgacatcccggtgag (3′-MK2), and 5′-tgctcgctcgatgcgatgtttcgc (Neo). A fragment length of about 500 bp indicates wild type and 800-bp stands for the deletion. For genotyping of TNF the primers 5′-ccttcctcacagagccagccccctc (sense) and 5′-aattacggttaggctcctgtttcc (antisense) were used for PCR. The fragments obtained are about 500 bp for wild type and 620 bp for ΔARE. Spleen cell culture and stimulation was done as described in Ref. 6Kotlyarov A. Neininger A. Schubert C. Eckert R. Birchmeier C. Volk H.D. Gaestel M. Nat. Cell Biol. 1999; 1: 94-97Crossref PubMed Scopus (687) Google Scholar. For macrophage assays, total exudate peritoneal macrophages (TEPM) were isolated by peritoneal lavage from 10-week-old mice, 3 days after a single peritoneal injection of 1.0 ml of thioglycollate broth (4%, Difco Laboratories). For cytokine measurements, TEPM were plated at a density of 5 × 105 cells/well in 24-well tissue culture tissue culture plates. Following adherence, cultures were stimulated with 1 ml of complete RPMI medium + 5% fetal bovine serum in the presence or absence 1 μg/ml LPS (Salmonella enteriditis, Sigma L-6011) for the indicated time points. For the detection of lymphocyte derived TNF, total splenocytes were isolated from mouse spleens via mechanical dissociation. Following erythrocyte lysis, cells were set onto tissue culture plates to remove the adherent fraction of splenocytes corresponding to myeloid cells. The nonadherent fraction was collected, counted, and plated into 24-well plates at a density of 5 × 106 cells/ml/well in the presence or absence of coated 10 μg/ml agonistic monoclonal anti-CD3 antibody (Clone 145-2C11, Low Endotoxin/PharMingen) to activate T-lymphocytes. Supernatants were collected following centrifugation at the indicated time points. Murine TNF immunoreactivity of cultured supernatants (diluted ¼– 110) was measured using specific ELISA as described previously (15Kontoyiannis D. Pasparakis M. Pizarro T.T. Cominelli F. Kollias G. Immunity. 1999; 10: 387-398Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1109) Google Scholar). Murine IL-6 immunoreactivity of cultured supernatants (diluted ½– 18) was measured using a specific ELISA (Endogen) according to the manufacturer's instructions. Bone marrow-derived macrophages were treated with 5 μg/ml LPS (Escherichia coli, Sigma L-6529) for 1 h and subsequent adding of actinomycin D (10 μg/ml). Total RNA was isolated from 1 × 104 cells at different times after actinomycin D treatment using RNApure (PeqLab). RNAs were separated in 1.25% agarose-formaldehyde gels, transfered to nitrocellulose, and hybridized to 32P-labeled IL-6 or TNF cDNA probes (6Kotlyarov A. Neininger A. Schubert C. Eckert R. Birchmeier C. Volk H.D. Gaestel M. Nat. Cell Biol. 1999; 1: 94-97Crossref PubMed Scopus (687) Google Scholar). The mRNA levels were normalized by stripping and reprobing the membranes with a 514-bp β-actin cDNA probe. Northern blots were analyzed by phosphorimaging. Decay of β-globin mRNA carrying an insertion of the IL-6 3′-UTR (nucleotides 767–1022) was monitored using the tet-offsystem as described previously for IL-8 3′-UTR (11Winzen R. Kracht M. Ritter B. Wilhelm A. Xu N. Shyu A.B. Müller M. Gaestel M. Resch K. Holtmann H. EMBO J. 1999; 18: 4969-4980Crossref PubMed Scopus (713) Google Scholar). For detection of mRNA levels in spleen cells, mice were injected with LPS (S. typhosa; Sigma L-7895) at 5 mg/kg body weight. After 90 min total RNA was isolated from spleens, and 20 μg of RNA were analyzed as described above. To test whether the post-transcriptional regulation of TNF biosynthesis by MK2 proceeds via the ARE of the TNF gene, we analyzed LPS-induced TNF production in systems where both MK2 and the ARE are deleted. In the case that the ARE is a downstream regulatory element of MK2 signaling for TNF biosynthesis, its deletion should lead to MK2 independence of LPS-induced TNF production. We crossed MK2−/− animals with the mouse strain carrying a 69-base pair deletion of the ARE in the 3′-UTR of the TNF gene TNFΔARE/− (15Kontoyiannis D. Pasparakis M. Pizarro T.T. Cominelli F. Kollias G. Immunity. 1999; 10: 387-398Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1109) Google Scholar). Since offspring carrying the genotype MK2−/−TNFΔARE/ΔARE were not viable, we selected mice with the genotypes MK2+/+TNF+/+, MK2−/−TNF+/+, MK2+/+TNFΔARE/+, and MK2−/−TNFΔARE/+ from the F2 generation for further analysis. Splenocytes from these mice were stimulated with LPSin vitro. As seen from Fig.1A, deletion of the ARE in only one allele leads to an almost complete restoration of LPS-induced TNF biosynthesis in the absence of MK2. When thioglycollate-elicited peritoneal macrophages of the different genotypes were stimulated by LPS in vitro (Fig. 1B), a similar result was obtained: deletion of the ARE leads to a re-establishment of TNF production leading to wild type levels after 3 and 6 h and to levels even significantly above the wild type macrophages 12 h after stimulation. This findings indicate that the ARE is downstream to the protein kinase MK2 at the same genetically defined LPS-signaling pathway and that MK2 directly or indirectly targets this element in the TNF-α mRNA. Interestingly, when a spleen cell population was stimulated by antibodies against the CD3 component of the T-cell receptor, deletion of the ARE even leads to a significant increase of TNF production compared with wild type animals, and this increase was independent of MK2 (Fig. 1C). Since it has already been shown that other hemopoietic cell types such as T-cells overproduce TNF as well (15Kontoyiannis D. Pasparakis M. Pizarro T.T. Cominelli F. Kollias G. Immunity. 1999; 10: 387-398Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1109) Google Scholar), this finding indicates that the MK2/ARE axis is also functioning in these cells to activate TNF production following CD3 or antigen engagement similar to the case of LPS-induced macrophages. So far, it was not clear whether the reduced biosynthesis of cytokines like IL-6, IL-1β, and IFN-γ in MK2−/− animals is an indirect effect due to the lack of production of the pro-inflammatory cytokine TNF. Alterations in the serum level of IL-6 have been observed as a secondary effect,e.g. in mice lacking TNF (16Marino M.W. Dunn A. Grail D. Inglese M. Noguchi Y. Richards E. Jungbluth A. Wada H. Moore M. Williamson B. Basu S. Old L.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 8093-8098Crossref PubMed Scopus (698) Google Scholar) and IL-1β (17Alheim K. Chai Z. Fantuzzi G. Hasanvan H. Di Malinowsky D. Santo E. Ghezzi P. Dinarello C.A. Bartfai T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 2681-2686Crossref PubMed Scopus (89) Google Scholar). To decide whether this is also the case in MK2−/− animals, we analyzed IL-6 production in splenocytes and macrophages of the MK2−/− TNFΔARE/+ animals. Although the absolute values of IL-6 production are lower in the ΔARE/+ spleen cell population probably due to a reduced representation of IL-6 producing cells, a comparable relative reduction of IL-6 levels (to about 30%) as a result of ablation of MK2 is observed in both the MK2−/− TNFΔARE/+ and the MK2−/− TNF+/+ background (Fig.2A). Analysis of LPS-stimulated IL-6 production of thioglycollate-elicited peritoneal macrophages shows similar and even more clear data (Fig.2B). For the same MK2 genotype, there is no significant difference in IL-6 production between the ΔARE/+ background, where TNF production is restored and even increased above wild type levels and the TNF +/+ background. This result clearly indicates that the defect in IL-6 biosynthesis in MK2−/− animals is not a secondary effect of reduced TNF production but independent of TNF. When looking at IL-6 mRNA levels in the different spleen cell cultures analyzed (Fig. 2C), a reduction of IL-6 mRNA, which correlates to the decreased biosynthesis of this cytokine in MK2−/−TNF+/+ and MK2−/−TNFΔARE/+ cells (as shown in Fig.2A), is observed. This indicates that the production of IL-6 is regulated at the level of transcription or stability of mRNA. To further analyze the mechanism by which MK2 determines the level of IL-6 mRNA we blocked transcription in LPS-stimulated macrophages from MK2+/+ and MK2−/− animals by using actinomycin D and analyzed half-life of the mRNA by Northern blotting. For comparison, we also determined the stability of TNF mRNA (Fig.3A). As a control, actin mRNA was detected and used to normalize the IL-6 and TNF mRNA level to equal loading. A quantitative evaluation of the mRNA decay (Fig. 3B) reveals a half-life of more than 20 h for IL-6 mRNA in LPS-stimulated MK2+/+ macrophages. Interestingly, in macrophages lacking MK2 its half-life is reduced 10-fold to about 2 h. This result provides the first direct genetic evidence for the involvement of MK2 in regulating mRNA stability. TNF mRNA is about 20-fold less stable than IL-6 mRNA in MK2+/+ cells. This is probably due to the more classical ARE in the TNF 3′-UTR compared with the AU-rich ARE-like motifs in the IL-6 3′-UTR (see below). Remarkably, the lack of MK2 in the macrophages leads only to a weak further destabilization of TNF mRNA reducing the half-life from 76 to 51 min. These data indicate that MK2 can regulate the stability of different cytokine mRNAs to a different degree. For IL-6 the 10-fold destabilization of mRNA could well explain the about 70% decrease in IL-6 protein biosynthesis in response to LPS in macrophages lacking MK2. However, the very weak destabilization of TNF mRNA in MK2-deficient macrophages compared with wild type cells cannot explain the 90% reduction of TNF biosynthesis observed. This finding supports the notion that MK2 regulates TNF biosynthesis mainly at the level of mRNA translation (10Han J. Brown T. Beutler B. J. Exp. Med. 1990; 171: 465-475Crossref PubMed Scopus (431) Google Scholar, 15Kontoyiannis D. Pasparakis M. Pizarro T.T. Cominelli F. Kollias G. Immunity. 1999; 10: 387-398Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1109) Google Scholar). Since AREs in the 3′-UTR of cytokine mRNAs are made responsible for both translational control (10Han J. Brown T. Beutler B. J. Exp. Med. 1990; 171: 465-475Crossref PubMed Scopus (431) Google Scholar, 18Kruys V. Marinx O. Shaw G. Deschamps J. Huez G. Science. 1989; 245: 852-855Crossref PubMed Scopus (270) Google Scholar) and mRNA stability (8Shaw G. Kamen R. Cell. 1986; 46: 659-667Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (3124) Google Scholar, 9Chen C.Y. Shyu A.B. Trends Biochem. Sci. 1995; 20: 465-470Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1688) Google Scholar), we examined whether the ARE-containing 3′-UTR of IL-6 is sufficient to confer MK2-dependent stabilization to a reporter mRNA. It is interesting to note that in the 3′-UTR of mouse or human IL-6 mRNA there are no overlapping pentanucleotide cores of AUUUA. Instead, they are scattered in an ARE-like region with varying U stretches of 2–5 nucleotides in length (Fig.4A). These regions of the human and mouse gene exhibit high homology to each other. To clarify their functional role we inserted the 3′-UTR region of human IL-6, including several AU-rich sequences (nt 767–1022, Fig. 4A), into the 3′-UTR of a β-globin genomic sequence and expressed the chimeric RNA using the tet-off system in HeLa cells (11Winzen R. Kracht M. Ritter B. Wilhelm A. Xu N. Shyu A.B. Müller M. Gaestel M. Resch K. Holtmann H. EMBO J. 1999; 18: 4969-4980Crossref PubMed Scopus (713) Google Scholar). After addition of doxycycline to the cells transcription of the reporter mRNA (BBB-IL-6767–1022) is blocked, and mRNA decay can be followed. As seen in Fig. 4B the reporter construct shows a relatively short half-life (∼30 min) in HeLa cells co-transfected with a control vector, indicating that the IL-6 3′-UTR-derived sequence destabilizes the globin mRNA, which is very stable in its nonfused form (half-life > 300 min, Ref. 19Xu N. Loflin P. Chen C.Y. Shyu A.B. Nucleic Acids Res. 1998; 26: 558-565Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar). Co-expression of a constitutively active mutant of MK2, MK2EE (20Engel K. Schultz H. Martin F. Kotlyarov A. Plath K. Hahn M. Heinemann U. Gaestel M. J. Biol. Chem. 1995; 270: 27213-27221Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (95) Google Scholar), as well as of the activator for p38 MAPK/SAPK2, MKK62E (21Raingeaud J. Whitmarsh A.J. Barrett T. Derijard B. Davis R.J. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 1247-1255Crossref PubMed Scopus (1150) Google Scholar), lead to a significant stabilization of the reporter mRNA (half-life about 120 min). Furthermore, a negative interfering mutant of MK2, MK2K76R (11Winzen R. Kracht M. Ritter B. Wilhelm A. Xu N. Shyu A.B. Müller M. Gaestel M. Resch K. Holtmann H. EMBO J. 1999; 18: 4969-4980Crossref PubMed Scopus (713) Google Scholar), can at least partially block the MKK62E-stimulated stabilization of the reporter mRNA (Fig. 4B, half-life of about 120 min reduced to about 60 min). Stability of a β-globin reporter RNA carrying the 3′-UTR of murine IL-6 was affected in the same way (not shown). These data indicate that MK2 can regulate IL-6 mRNA stability in an 3′-UTR-dependent manner. We have demonstrated that in the LPS response AU-rich elements are downstream to the protein kinase MK2 and that MK2 regulates TNF-α and IL-6 biosynthesis independently. Regulation of TNF proceeds through the ARE in the mRNA, since deletion of this ARE leads to restoration of TNF biosynthesis in the absence of MK2. In cells where TNF biosynthesis is re-established, MK2 is still necessary for IL-6 induction, indicating that reduced IL-6 levels are not a secondary effect of the reduction of TNF. The defect of IL-6 synthesis correlates with decreased mRNA levels, and it is shown that the absence of MK2 leads to a 10-fold increased degradation rate of IL-6 mRNA in LPS-stimulated macrophages. Furthermore, MK2 can stabilize an mRNA reporter construct carrying the IL-6 3′-UTR, which contains ARE-like motifs. The data presented do not directly exclude that MK2 is also necessary for transcriptional stimulation of the IL-6 gene. However, since it is known that activated MK2 is rapidly translocated to the cytoplasm of the cell (24Engel K. Kotlyarov A. Gaestel M. EMBO J. 1998; 17: 3363-3371Crossref PubMed Scopus (236) Google Scholar), it seems likely that regulation of the IL-6 mRNA level by MK2 is mainly the result of altered stability of its mRNA in the cytoplasm. Interestingly, degradation of TNF mRNA in the absence of MK2 is increased only marginally. This is in agreement with the finding that the p38 MAPK/ARE axis mainly regulates translation of TNF mRNA and not its absolute level or stability (6Kotlyarov A. Neininger A. Schubert C. Eckert R. Birchmeier C. Volk H.D. Gaestel M. Nat. Cell Biol. 1999; 1: 94-97Crossref PubMed Scopus (687) Google Scholar, 15Kontoyiannis D. Pasparakis M. Pizarro T.T. Cominelli F. Kollias G. Immunity. 1999; 10: 387-398Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1109) Google Scholar) and that TNF mRNA stability and hypoadenylation are not significantly altered in LPS-stimulated macrophages (23Mijatovic T. Houzet L. Defrance P. Droogmans L. Huez G. Kruys V. Eur. J. Biochem. 2000; 267: 6004-6012Crossref PubMed Scopus (40) Google Scholar). Other studies also indicate that, depending on the cellular context, TNF mRNA is also regulated on the stability level, and ARE-binding proteins such as tristetraprolin (TTP) (25Carballo E. Lai W.S. Blackshear P.J. Science. 1998; 281: 1001-1005Crossref PubMed Google Scholar) or HuR (26Dean J.L. Wait R. Mahtani K.R. Sully G. Clark A.R. Saklatvala J. Mol. Cell. Biol. 2001; 21: 721-730Crossref PubMed Scopus (250) Google Scholar), which decrease or increase its half-life, have been described. However, ARE-binding proteins such as TIAR (27Gueydan C. Droogmans L. Chalon P. Huez G. Caput D. Kruys V. J. Biol. Chem. 1999; 274: 2322-2326Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (235) Google Scholar) and TIA-1 (28Piecyk M. Wax S. Beck A.R. Kedersha N. Gupta M. Maritim B. Chen S. Gueydan C. Kruys V. Streuli M. Anderson P. EMBO J. 2000; 19: 4154-4163Crossref PubMed Scopus (424) Google Scholar) confer specific translational regulation of the TNF mRNA. Deletion of TIA-1 from mouse macrophages does not alter transcript stability but increases the level of TNF mRNA that is associated with the polysomes (28Piecyk M. Wax S. Beck A.R. Kedersha N. Gupta M. Maritim B. Chen S. Gueydan C. Kruys V. Streuli M. Anderson P. EMBO J. 2000; 19: 4154-4163Crossref PubMed Scopus (424) Google Scholar), strongly indicating translational control of TNF. Obviously, MK2 is an element of a signaling mechanism that can regulate biosynthesis of different cytokines via their different AU-rich 3′-UTRs in parallel and on different levels. So far, it is not clear whether there is a signaling branch point downstream to MK2 with different ARE-binding protein substrates such as TTP or HuR responsible for regulation of stability and others such as TIAR and TIA-1 responsible for regulation of translation. To us, it also seems possible that MK2 phosphorylates a so far unknown target, which can directly or indirectly interact with AREs and which regulates stability and/or translation of the mRNA, depending on the context of the particular ARE and other ARE-binding proteins.

The mitogen-activated protein kinase (MAPK) p38/MAPK-activated protein kinase 2 (MK2) signaling pathway plays an important role in the posttranscriptional regulation of tumor necrosis factor (TNF), which is dependent on the adenine/uridine-rich element (ARE) in the 3′ untranslated region of TNF mRNA. After lipopolysaccharide (LPS) stimulation, MK2-deficient macrophages show a 90% reduction in TNF production compared to the wild type. Tristetraprolin (TTP), a protein induced by LPS, binds ARE and destabilizes TNF mRNA. Accordingly, macrophages lacking TTP produce large amounts of TNF. Here, we generated MK2/TTP double knockout mice and show that, after LPS stimulation, bone marrow-derived macrophages produce TNF mRNA and protein levels comparable to those of TTP knockout cells, indicating that in the regulation of TNF biosynthesis TTP is genetically downstream of MK2. In addition, we show that MK2 is essential for the stabilization of TTP mRNA, and phosphorylation by MK2 leads to increased TTP protein stability but reduced ARE affinity. These data suggest that MK2 inhibits the mRNA destabilizing activity of TTP and, in parallel, codegradation of TTP together, with the target mRNA resulting in increased cellular levels of TTP.

Abstract The TNF receptor-interacting protein kinases (RIPK)-1 and 3 are regulators of extrinsic cell death response pathways, where RIPK1 makes the cell-survival or death decisions by associating with distinct complexes mediating survival signaling, caspase activation or RIPK3-dependent necroptotic cell death in a context dependent manner. Using a mass spectrometry-based screen to find new components of the ripoptosome/necrosome, we discovered the protein-arginine methyltransferase (PRMT)-5 as a direct interaction partner of RIPK1. Interestingly, RIPK3 but not RIPK1 was then found a target of PRMT5-mediated symmetric arginine dimethylation. A conserved arginine residue in RIPK3 (R486 in human, R415 in mouse) was identified as the evolutionarily conserved target for PRMT5-mediated symmetric dimethylation and the mutations R486A and R486K in human RIPK3 almost completely abrogated its methylation. Rescue experiments using these non-methylatable mutants of RIPK3 demonstrated PRMT5-mediated RIPK3 methylation to act as an efficient mechanism of RIPK3-mediated feedback control on RIPK1 activity and function. Therefore, this study reveals PRMT5-mediated RIPK3 methylation as a novel modulator of RIPK1-dependent signaling.

ERK3/MAPK6 (MAPK6 gene) along with its paralog ERK4/MAPK4 (MAPK4 gene) define a distinct subfamily of atypical mitogen-activated protein kinases (MAPKs). Much remains to be learned about the substrates and biological functions of these signaling enzymes. Interestingly, recent work has suggested that ERK4 promotes prostate cancer progression via the non-canonical activation of AKT/mTOR signaling. In their recent study, Wang et al. report that ERK4 is expressed in a subset of triple-negative breast cancer (TNBC) cell lines and that this expression is critical for AKT activation and for sustaining TNBC cell proliferation in vitro and tumor growth in mice. They also show that depletion of ERK4 sensitizes TNBC cells to phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) inhibitors. They conclude that ERK4 is a promising therapeutic target for TNBC and has potential for combination therapy with PI3K inhibitors. Here, we raise concerns about the cellular models and experimental approaches used in this study, which compromises the conclusions on the oncogenic role of ERK4 in TNBC.

Abstract Receptor-interacting protein kinases (RIPK) −1 and −3 are master regulators of cell fate decisions in response to diverse stimuli and are subjected to multiple checkpoint controls. Earlier studies have established the presence of distinct IKK1/2 and p38/MK2-dependent checkpoints which suppress RIPK1 activation by directly phosphorylating it at different residues. In the present study, we investigated TNF-induced death in MAPK-activated protein kinase 2 (MK2)-deficient cells and show that MK2-deficiency or inactivation predominantly results in necroptotic cell death, even in the absence of caspase inhibition. While MK2-deficient cells can be rescued from necroptosis by RIPK1 inhibitors, RIPK3 inhibition seems to revert the process triggering apoptosis. To understand the mechanism of this necroptosis switch, we screened a 149-compound kinase inhibitor library for compounds which preferentially sensitize MK2-deficient MEFs to TNF-induced cell death. The most potent inhibitor identified was 5-Iodotubericidin, an adenosine analogue acting as adenosine kinase and protein kinase inhibitor. 5-ITu also potentiated LPS-induced necroptosis when combined with MK2 inhibition in RAW264.7 macrophages. Further mechanistic studies revealed that 5-Iodotubericidin induces RIPK1-dependent necroptosis in the absence of MK2 activity by suppressing IKK signaling. The identification of this role for the multitarget kinase inhibitor 5-ITu in TNF-, LPS- and chemotherapeutics-induced necroptosis will have potential implications in RIPK1-targeted therapies.

Abstract Constitutive activation of the ATF4-mediated integrated stress response (ATF4-ISR) is common in cancer and buffers the metabolic challenges imposed by rapid proliferation. However, hyperactivation of the ISR can induce apoptosis. Here we demonstrate that novel pyrazolo-thiazole derivates activate the mitochondrial protease OMA1 which subsequently induces apoptosis in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cells. Apoptosis is dependent on the OMA1 mediated cleavage of DELE1 which leads to activation of HRI and induction of the ATF4 ISR. Screening in 406 cancer cell lines identified an inverse correlation between sensitivity to OMA1 activators and expression of the mitochondrial protein FAM210B. Ectopic overexpression of FAM210B specifically blocks OMA1 activation and apoptosis induction by pyrazolo-thiazole activators in DLBCL. OMA1 activators, including the preclinical candidate BTM-3566, selectively killed ABC, GCB, and double-hit DLBCL lines and induced complete tumor regression across a panel of DLBCL patient-derived xenografts. Significance Here we describe a novel class of small molecules that activate the mitochondrial protease OMA1 and induce therapeutic responses in DLBCL preclinical models in vitro and in vivo. OMA1 activation drives apoptosis through ATF4-ISR, an orthogonal mechanism to current therapies.

MAPK6/ERK3 is an atypical member of the MAPKs. An essential role has been suggested by the perinatal lethal phenotype of ERK3 knockout mice carrying a lacZ insertion in exon 2 due to pulmonary disfunction and by defects in function, activation and positive selection of T cells. To study the role of ERK3 in vivo, we generated mice carrying a conditional Erk3 allele with exon3 flanked by LoxP sites. Loss of ERK3 protein was validated after deletion of Erk3 in the female germ line using zona pellucida 3 (Zp3)-cre and a clear reduction of the protein kinase MK5 is detected, providing first evidence for the existence of the ERK3/MK5 signaling complex in vivo. In contrast to the previously reported Erk3 knockout phenotype, these mice are viable and fertile, do not display pulmonary hypoplasia, acute respiratory failure, abnormal T cell development, reduction of thymocyte numbers or altered T cells selection. Hence, ERK3 is dispensable for pulmonary and T-cell functions. The perinatal lethality, lung and T-cell defects of the previous ERK3 knockout mice are likely due to ERK3-unrelated effects of the inserted lacZ-neomycin-resistance-cassette. The knockout mouse of the closely related atypical MAPK ERK4/MAPK4 is also normal suggesting redundant functions of both protein kinases.