The pleiotropic lipid mediator sphingosine-1-phosphate (S1P) can act intracellularly independently of its cell surface receptors through unknown mechanisms. Sphingosine kinase 2 (SphK2), one of the isoenzymes that generates S1P, was associated with histone H3 and produced S1P that regulated histone acetylation. S1P specifically bound to the histone deacetylases HDAC1 and HDAC2 and inhibited their enzymatic activity, preventing the removal of acetyl groups from lysine residues within histone tails. SphK2 associated with HDAC1 and HDAC2 in repressor complexes and was selectively enriched at the promoters of the genes encoding the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 or the transcriptional regulator c-fos, where it enhanced local histone H3 acetylation and transcription. Thus, HDACs are direct intracellular targets of S1P and link nuclear S1P to epigenetic regulation of gene expression.

TRAF2 (tumour-necrosis factor receptor-associated factor 2), a component of the NF-κB activation pathway important in inflammatory, anti-apoptotic, and immune processes, is shown to be a target of sphingosine kinase 1, one of the isoenzymes that generates the pro-survival lipid mediator sphingosine-1-phosphate inside cells. In addition, sphingosine kinase 1 is revealed as the 'missing' cofactor for TRAF2 E3 ubiquitin ligase activity. These findings provide a mechanistic explanation for the numerous observations of the importance of SphK1 in inflammatory, anti-apoptotic and immune processes. Engagement of the tumour-necrosis factor (TNF) receptor results in the assembly of multi-component signalling complexes by adaptor proteins that include TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2). Genetic evidence indicates that TRAF2 is needed for the polyubiquitination of receptor interacting protein 1 (RIP1), but direct evidence has been lacking. Here it is shown that the lipid sphingosine-1-phosphate is a co-factor needed for this ubiquitination activity of TRAF2. Tumour-necrosis factor (TNF) receptor-associated factor 2 (TRAF2) is a key component in NF-κB signalling triggered by TNF-α1,2. Genetic evidence indicates that TRAF2 is necessary for the polyubiquitination of receptor interacting protein 1 (RIP1)3 that then serves as a platform for recruitment and stimulation of IκB kinase, leading to activation of the transcription factor NF-κB. Although TRAF2 is a RING domain ubiquitin ligase, direct evidence that TRAF2 catalyses the ubiquitination of RIP1 is lacking. TRAF2 binds to sphingosine kinase 1 (SphK1)4, one of the isoenzymes that generates the pro-survival lipid mediator sphingosine-1-phosphate (S1P) inside cells. Here we show that SphK1 and the production of S1P is necessary for lysine-63-linked polyubiquitination of RIP1, phosphorylation of IκB kinase and IκBα, and IκBα degradation, leading to NF-κB activation. These responses were mediated by intracellular S1P independently of its cell surface G-protein-coupled receptors. S1P specifically binds to TRAF2 at the amino-terminal RING domain and stimulates its E3 ligase activity. S1P, but not dihydro-S1P, markedly increased recombinant TRAF2-catalysed lysine-63-linked, but not lysine-48-linked, polyubiquitination of RIP1 in vitro in the presence of the ubiquitin conjugating enzymes (E2) UbcH13 or UbcH5a. Our data show that TRAF2 is a novel intracellular target of S1P, and that S1P is the missing cofactor for TRAF2 E3 ubiquitin ligase activity, indicating a new paradigm for the regulation of lysine-63-linked polyubiquitination. These results also highlight the key role of SphK1 and its product S1P in TNF-α signalling and the canonical NF-κB activation pathway important in inflammatory, antiapoptotic and immune processes.

Sphingolipids are a highly diverse category of compounds that serve not only as components of biologic structures but also as regulators of numerous cell functions. Because so many of the sphingolipids in a biological system are bioactive and are often closely related structurally and metabolically (for example, complex sphingolipids ↔ ceramide ↔ sphingosine ↔ sphingosine 1-phosphate), to understand the role(s) of sphingolipids in a given context one must conduct a "sphingolipidomic" analysis—i.e., a structure-specific and quantitative measurement of all of these compounds, or at least all members of a critical subset. Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC MS/MS) is currently the only technology with the requisite structural specificity, sensitivity, quantitative precision, and relatively high-throughput capabilities for such analyses in small samples (∼106 cells). This review describes a series of protocols that have been developed for the relatively rapid analysis of all of the molecular species from 3-ketosphinganines through sphingomyelins and some glycosphingolipids (including all the compounds that are presently regarded as sphingolipid "second messengers") using normal- and reverse-phase LC to separate isometric and isobaric species (such as glucosylceramides and galactosylceramides) in combination with triple quadrupole (for MS/MS) and hybrid quadrupole–ion trap (for MS3) mass spectrometry. Also discussed are some of the issues remaining to be resolved in the analysis of the full sphingolipidome.

Inflammatory bowel disease is an important risk factor for colorectal cancer. We show that sphingosine-1-phosphate (S1P) produced by upregulation of sphingosine kinase 1 (SphK1) links chronic intestinal inflammation to colitis-associated cancer (CAC) and both are exacerbated by deletion of Sphk2. S1P is essential for production of the multifunctional NF-κB-regulated cytokine IL-6, persistent activation of the transcription factor STAT3, and consequent upregulation of the S1P receptor, S1PR1. The prodrug FTY720 decreased SphK1 and S1PR1 expression and eliminated the NF-κB/IL-6/STAT3 amplification cascade and development of CAC, even in Sphk2−/− mice, and may be useful in treating colon cancer in individuals with ulcerative colitis. Thus, the SphK1/S1P/S1PR1 axis is at the nexus between NF-κB and STAT3 and connects chronic inflammation and CAC.

The potent lipid mediator sphingosine-1-phosphate (S1P) regulates diverse physiological processes by binding to 5 specific GPCRs, although it also has intracellular targets. Here, we demonstrate that S1P, produced in the mitochondria mainly by sphin-gosine kinase 2 (SphK2), binds with high affinity and specificity to prohibitin 2 (PHB2), a highly conserved protein that regulates mitochondrial assembly and function. In contrast, S1P did not bind to the closely related protein PHB1, which forms large, multimeric complexes with PHB2. In mitochondria from SphK2-null mice, a new aberrant band of cytochrome-c oxidase was detected by blue native PAGE, and interaction between subunit IV of cytochrome-c oxidase and PHB2 was greatly reduced. Moreover, depletion of SphK2 or PHB2 led to a dysfunction in mitochondrial respiration through cytochrome-c oxidase. Our data point to a new action of S1P in mitochondria and suggest that interaction of S1P with homomeric PHB2 is important for cytochrome-c oxidase assembly and mitochondrial respiration.—Strub, G. M., Paillard, M., Liang, J., Gomez, L., Allegood, J. C., Hait, N. C., Maceyka, M., Price, M. M., Chen, Q., Simpson, D. C., Kordula, T., Milstien, S., Lesnefsky, E. J., Spiegel, S. Sphingosine-1-phos-phate produced by sphingosine kinase 2 in mitochondria interacts with prohibitin 2 to regulate complex IV assembly and respiration. FASEB J. 25, 600–612 (2011). www.fasebj.org

Abstract Sphingosine-1-phosphate (S1P) is a pleiotropic bioactive lipid mediator that promotes breast cancer progression by diverse mechanisms that remain somewhat unclear. Here we report pharmacologic evidence of a critical role for sphingosine kinase 1 (SphK1) in producing S1P and mediating tumor-induced hemangiogenesis and lymphangiogenesis in a murine model of breast cancer metastasis. S1P levels increased both in the tumor and the circulation. In agreement, serum S1P levels were significantly elevated in stage IIIA human breast cancer patients, compared with age/ethnicity-matched healthy volunteers. However, treatment with the specific SphK1 inhibitor SK1-I suppressed S1P levels, reduced metastases to lymph nodes and lungs, and decreased overall tumor burden of our murine model. Both S1P and angiopoietin 2 (Ang2) stimulated hemangiogenesis and lymphangiogenesis in vitro, whereas SK1-I inhibited each process. We quantified both processes in vivo from the same specimen by combining directed in vivo angiogenesis assays with fluorescence-activated cell sorting, thereby confirming the results obtained in vitro. Notably, SK1-I decreased both processes not only at the primary tumor but also in lymph nodes, with peritumoral lymphatic vessel density reduced in SK1-I–treated animals. Taken together, our findings show that SphK1-produced S1P is a crucial mediator of breast cancer–induced hemangiogenesis and lymphangiogenesis. Our results implicate SphK1 along with S1P as therapeutic targets in breast cancer. Cancer Res; 72(3); 726–35. ©2012 AACR.

Sphingosine 1-phosphate (S1P), a potent sphingolipid mediator produced by sphingosine kinase isoenzymes (SphK1 and SphK2), regulates diverse cellular processes important for breast cancer progression acting in an autocrine and/or paracrine manner. Here we show that SphK1, but not SphK2, increased S1P export from MCF-7 cells. Whereas for both estradiol (E2) and epidermal growth factor-activated SphK1 and production of S1P, only E2 stimulated rapid release of S1P and dihydro-S1P from MCF-7 cells. E2-induced S1P and dihydro-S1P export required estrogen receptor-α, not GPR30, and was suppressed either by pharmacological inhibitors or gene silencing of ABCC1 (multidrug resistant protein 1) or ABCG2 (breast cancer resistance protein). Inhibiting these transporters also blocked E2-induced activation of ERK1/2, indicating that E2 activates ERK via downstream signaling of S1P. Taken together, our findings suggest that E2-induced export of S1P mediated by ABCC1 and ABCG2 transporters and consequent activation of S1P receptors may contribute to nongenomic signaling of E2 important for breast cancer pathophysiology. Sphingosine 1-phosphate (S1P), a potent sphingolipid mediator produced by sphingosine kinase isoenzymes (SphK1 and SphK2), regulates diverse cellular processes important for breast cancer progression acting in an autocrine and/or paracrine manner. Here we show that SphK1, but not SphK2, increased S1P export from MCF-7 cells. Whereas for both estradiol (E2) and epidermal growth factor-activated SphK1 and production of S1P, only E2 stimulated rapid release of S1P and dihydro-S1P from MCF-7 cells. E2-induced S1P and dihydro-S1P export required estrogen receptor-α, not GPR30, and was suppressed either by pharmacological inhibitors or gene silencing of ABCC1 (multidrug resistant protein 1) or ABCG2 (breast cancer resistance protein). Inhibiting these transporters also blocked E2-induced activation of ERK1/2, indicating that E2 activates ERK via downstream signaling of S1P. Taken together, our findings suggest that E2-induced export of S1P mediated by ABCC1 and ABCG2 transporters and consequent activation of S1P receptors may contribute to nongenomic signaling of E2 important for breast cancer pathophysiology.

Abstract Background Activation of the farnesoid X receptor (FXR) reduces renal inflammation, but the underlying mechanisms remain elusive. Neutrophil extracellular traps (NETs) are webs of DNA formed when neutrophils undergo specialized programmed cell death (NETosis). Sphingosine-1-phosphate (S1P) is a signaling lipid that stimulates NETosis via its receptor on neutrophils. Here, we identify FXR as a negative regulator of kidney NETosis via repressing S1P signaling in male but not female mice. Methods We determined the effects of the FXR agonist obeticholic acid (OCA) in mouse models of adenosine phosphoribosyltransferase deficiency and Alport syndrome. We assessed renal NETosis by immunofluorescence in these models and in biopsies from patients with Alport syndrome (6 male, 9 female). We also inhibited de novo sphingosine production in Alport mice to show a causal relationship between S1P signaling and renal NETosis. Results Renal FXR activity is greatly reduced in both models, and OCA prevents kidney fibrosis, inflammation, and lipotoxicity. OCA reduces renal neutrophilic inflammation and NETosis in male adenine and Alport mice, but not in female adenine mice. Extensive NETosis was also identified in human Alport kidney biopsies. Kidney sphingosine kinase 1 (Sphk1) expression is increased in mice with kidney disease and reduced by OCA in male but not female mice. Also, Sphk1 expression correlates with NETosis in male but not female mice. Short-term inhibition of sphingosine synthesis reduces neutrophilic inflammation and NETosis. Conclusion FXR agonism represses kidney Sphk1 expression in male but not female mice. This inhibits renal S1P signaling, thereby reducing neutrophilic inflammation and NETosis in a sex-dependent manner.

Abstract Liver failure secondary to nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) has become the most common cause for liver transplantation in many parts of the world. Moreover, the prevalence of NAFLD not only increases the demand for liver transplantation, but also limits the supply of suitable donor organs because steatosis predisposes grafts to ischemia-reperfusion injury (IRI). There are currently no pharmacological interventions to limit hepatic IR injury because the mechanisms by which steatosis leads to increased injury are unclear. To identify potential novel mediators of IR injury, we used liquid chromatography and mass spectrometry to assess temporal changes in the hepatic lipidome in steatotic and non-steatotic livers after warm IRI in mice. Our untargeted analyses revealed distinct differences between the steatotic and non-steatotic response to IRI and highlighted dynamic changes in lipid composition with marked changes in glycerolipids and glycerophospholipids. These findings enhance our knowledge of the lipidomic changes that occur following IRI and provide a foundation for future mechanistic studies. A better understanding of the mechanisms underlying such changes will lead to novel therapeutic strategies to combat IR injury.