Recent efforts in genome mining of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) have expanded the diversity of post-translational modification chemistries 1, 2 . However, RiPPs are rarely reported as hybrid molecules incorporating biosynthetic machineries from other natural product families 3–8 . Here, we report lipoavitides, a class of RiPP/fatty acid hybrid lipopeptides that display a unique, membrane-targeting 4-hydroxy-2,4-dimethylpentanoyl (HMP)-modified N -terminus. The HMP is formed via condensation of isobutyryl-CoA and methylmalonyl-CoA catalyzed by a 3-ketoacyl-ACP synthase III enzyme, followed by successive tailoring reactions in the fatty acid biosynthetic pathway. The HMP and RiPP substructures are then connected by an acyltransferase exhibiting promiscuous activity towards the fatty acyl and RiPP substrates. Overall, the discovery of lipoavitides contributes a prototype of RiPP/fatty acid hybrids and provides possible enzymatic tools for lipopeptide bioengineering.

Abstract Natural products (NPs) produced by bacteria, fungi and plants are a major source of drug leads. Streptomyces species are particularly important in this regard as they produce numerous natural products with prominent bioactivities. Here we report a fully a utomated, s calable and high-throughput platform for discovery of bioactive n atural p roducts in S treptomyces (FAST-NPS). This platform comprises computational prediction and prioritization of target biosynthetic gene clusters (BGCs) guided by self-resistance genes, highly efficient and automated direct cloning and heterologous expression of BGCs, followed by high-throughput fermentation and product extraction from Streptomyces strains. As a proof of concept, we applied this platform to clone 105 BGCs ranging from 10 to 100 kb that contain potential self-resistance genes from 11 Streptomyces strains with a success rate of 95%. Heterologous expression of all successfully cloned BGCs in Streptomyces lividans TK24 led to the discovery of 23 natural products from 12 BGCs. We selected 5 of these 12 BGCs for further characterization and found each of them could produce at least one natural product with antibacterial and/or anti-tumor activity, which resulted in a total of 8 bioactive natural products. Overall, this work would greatly accelerate the discovery of bioactive natural products for biomedical and biotechnological applications. Graphic Abstracts

Abstract The plant-sourced polyketide triacetic acid lactone (TAL) has been recognized as a promising platform chemical for the biorefinery industry. However, its practical application was rather limited due to low natural abundance and inefficient cell factories for biosynthesis. Here we report the metabolic engineering of oleaginous yeast Rhodotorula toruloides for TAL overproduction. We first introduced a 2-pyrone synthase gene from Gerbera hybrida ( GhPS ) into R. toruloides and investigated the effects of different carbon sources on TAL production. We then systematically employed a variety of metabolic engineering strategies to increase the flux of acetyl-CoA by enhancing its biosynthetic pathways and disrupting its competing pathways. We found that overexpression of citrate lyase (ACL1) improved TAL production by 45% compared to the GhPS overexpressing strain, and additional overexpression of acetyl-CoA carboxylase (ACC1) further increased TAL production by 29%. Finally, we characterized the resulting strain I12- ACL1-ACC1 using fed-batch bioreactor fermentation in glucose or oilcane juice medium with acetate supplementation and achieved a titer of 28 g/L or 23 g/L TAL, respectively. This study demonstrates that R. toruloides is a promising host for production of TAL and other acetyl-CoA-derived polyketides from low-cost carbon sources. Graphical abstract Triacetic acid lactone (TAL) is a promising platform chemical. Cao et al. overexpressed 2-pyrone synthase in oleaginous yeast Rhodotorula toruloides to produce TAL. They systematically evaluated various metabolic gene targets to increase acetyl-CoA and malonyl-CoA levels for TAL production and found that overexpression of both ACL1 and ACC1 led to 28 g/L or 23 g/L of TAL from glucose or oilcane juice with acetate supplementation, respectively, in fed-batch fermentation.

The era of inexpensive genome sequencing and improved bioinformatics tools has reenergized the study of natural products, including the ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs). In recent years, RiPP discovery has challenged preconceptions about the scope of post-translational modification chemistry, but genome mining of new RiPP classes remains an unsolved challenge. Here, we report a RiPP class defined by an unusual ( S )- N2 , N2 -dimethyl-1,2-propanediamine (Dmp)-modified C -terminus, which we term the daptides. Nearly 500 daptide biosynthetic gene clusters (BGCs) were identified by analyzing the RiPP Recognition Element (RRE), a common substrate-binding domain found in half of prokaryotic RiPP classes. A representative daptide BGC from Microbacterium paraoxydans DSM 15019 was selected for experimental characterization. Derived from a C -terminal threonine residue, the class-defining Dmp is installed over three steps by an oxidative decarboxylase, aminotransferase, and methyltransferase. Daptides uniquely harbor two positively charged termini, and thus we suspect this modification could aid in membrane targeting, as corroborated by hemolysis assays. Our studies further show that the oxidative decarboxylation step requires a functionally unannotated accessory protein. Fused to the C -terminus of the accessory protein is an RRE domain, which delivers the unmodified substrate peptide to the oxidative decarboxylase. This discovery of a class-defining post-translational modification in RiPPs may serve as a prototype for unveiling additional RiPP classes through genome mining.