Structure-defined N-glycans are essential tools to uncover the molecular basis of N-glycan functions. However, the difficulty in obtaining diverse collections of well-defined N-glycans has always been an obstacle that greatly hampers progress in glycoscience. Here, we developed a general platform for the concise total synthesis of N-glycans. Using the designed strategy, the general N-glycan precursors, including core pentasaccharide and core tetrasaccharide, were successfully assembled from common starting materials in only a few facile chemical and enzymatic steps. Starting from core pentasaccharide and core tetrasaccharide, a variety of biantennary N-glycans were prepared successfully in large quantities by taking advantage of enzymatic diversification. In particular, reverse galactosylation was employed as a selective protecting strategy, by which complex asymmetric N-glycans could be obtained easily and efficiently.

Abstract As a major class of biomolecules, carbohydrates play indispensable roles in various biological processes. However, it remains largely unknown how carbohydrates directly modulate important drug targets, such as G-protein coupled receptors (GPCRs). Here, we employed P2Y purinoceptor 14 (P2Y14), a drug target for inflammation and immune responses, to uncover the sugar nucleotide activation of GPCRs. Integrating molecular dynamics simulation with functional study, we identified the uridine diphosphate (UDP)-sugar-binding site on P2Y14, and revealed that a UDP-glucose might activate the receptor by bridging the transmembrane helices (TM) 2 and 7. Between TM2 and TM7 of P2Y14, a conserved salt bridging chain (K 2.60 -D 2.64 -K 7.35 -E 7.36 , KDKE) was identified to distinguish different UDP-sugars, including UDP-glucose, UDP-galactose, UDP-glucuronic acid and UDP-N-acetylglucosamine. We identified the KDKE chain as a conserved functional motif of sugar binding for both P2Y14 and P2Y purinoceptor 12 (P2Y12), and then designed three sugar nucleotides as agonists of P2Y12. These results not only expand our understanding for activation of purinergic receptors but also provide insights for the carbohydrate drug development for GPCRs.

Nanopores are promising sensors for glycan analysis with the accurate identification of complex glycans laying the foundation for nanopore-based sequencing. However, their applicability toward continuous glycan sequencing has not yet been demonstrated. Here, we present a proof-of-concept of glycan sequencing by combining nanopore technology with glycosidase-hydrolyzing reactions. By continuously monitoring the changes in the characteristic current generated by the translocation of glycan hydrolysis products through a nanopore, the glycan sequence can be accurately identified based on the specificity of glycosidases. With machine learning, we improved the sequencing accuracy to over 98%, allowing for the reliable determination of consecutive building blocks and glycosidic linkages of glycan chains while reducing the need for operator expertise. This approach was validated on real glycan samples, with accuracy calibrated using hydrophilic interaction chromatography-high-performance liquid chromatography (HILIC-HPLC) and mass spectrometry (MS). We achieved the sequencing of ten consecutive units in natural glycan chains, which provided the first evidence for the feasibility of a nanopore-glycosidase-compatible system in glycan sequencing. Compared to traditional methods, this strategy enhances sequencing efficiency by over 5-fold. Additionally, we introduced the concept of 'inverse sequencing', which focuses on electrical signal changes rather than monosaccharide identification. This eliminates the reliance on glycan fingerprint libraries typically required in putative 'forward hydrolysis' strategies. When the challenges in both 'forward and inverse hydrolysis sequencing strategies' are addressed, this approach will pave the way for establishing a glycan sequencing technology at a single-molecule level.