Abstract Legumes of the Medicago genus form symbiosis with the bacterium Sinorhizobium meliloti and develop root nodules housing large numbers of the intracellular symbionts. Members of the Nodule-specific Cysteine Rich peptide (NCRs) family induce the endosymbionts into a terminal differentiated state. Individual cationic NCRs are antimicrobial peptides that have the capacity to kill the symbiont but the nodule cell environment prevents killing. Moreover, the bacterial broad-specificity peptide uptake transporter BacA and exopolysaccharides contribute to protect the endosymbionts against the toxic activity of NCRs. Here, we show that other S. meliloti functions participate in the protection of the endosymbionts, including an additional broad-specificity peptide uptake transporter encoded by the yejABEF genes, lipopolysaccharide modifications mediated by lpsB and lpxXL as well as rpoH1 , encoding a stress sigma factor. Mutants of these genes show in vitro a strain-specific increased sensitivity profile against a panel of NCRs and form nodules in which bacteroid differentiation is affected. The lpsB mutant nodule bacteria do not differentiate, the lpxXL and rpoH1 mutants form some seemingly fully differentiated bacteroids although most of the nodule bacteria are undifferentiated, while the yejABEF mutants form hypertrophied but nitrogen-fixing bacteroids. The nodule bacteria of all the mutants have a strongly enhanced membrane permeability, which is dependent on the transport of NCRs to the endosymbionts. Our results suggest that S. meliloti relies on a suite of functions including peptide transporters, the bacterial envelope structures and stress response regulators to resist the aggressive assault of NCR peptides in the nodule cells. Importance The nitrogen fixing symbiosis of legumes with rhizobium bacteria has a predominant ecological role in the nitrogen cycle and has the potential to provide the nitrogen required for plant growth in agriculture. The host plants allow the rhizobia to colonize specific symbiotic organs, the nodules, in large numbers in order to produce sufficient reduced nitrogen for the plant needs. Some legumes, including Medicago spp., produce massively antimicrobial peptides to keep this large bacterial population in check. These peptides, known as NCRs, have the potential to kill the rhizobia but in nodules, they rather inhibit the division of the bacteria, which maintain a high nitrogen fixing activity. In this study, we show that the tempering of the antimicrobial activity of the NCR peptides in the Medicago symbiont Sinorhizobium meliloti is multifactorial and requires the YejABEF peptide transporter, the lipopolysaccharide outer membrane composition and the stress response regulator RpoH1.

ABSTRACT Sinorhizobium meliloti is a soil bacterium that establishes a symbiosis within root nodules of legumes ( Medicago sativa , for example) where it fixes atmospheric nitrogen into ammonia and obtains in return carbon sources and other nutrients. In this symbiosis, S. meliloti undergoes a drastic cellular change leading to a terminal differentiated form (called bacteroid) characterized by genome endoreduplication, increase of cell size and high membrane permeability. The bacterial cell cycle (mis)regulation is at the heart of this differentiation process. In free-living cells, the master regulator CtrA ensures the progression of cell cycle by activating cell division (controlled by the tubulin-like protein FtsZ) and simultaneously inhibiting supernumerary DNA replication, while on the other hand the downregulation of CtrA and FtsZ is essential for bacteroid differentiation during symbiosis, preventing endosymbiont division and permitting genome endoreduplication. Little is known in S. meliloti about regulators of CtrA and FtsZ, as well as the processes that control bacteroid development. Here, we combine cell biology, biochemistry and bacterial genetics approaches to understand the function(s) of FcrX, a new factor that controls both CtrA and FtsZ, in free-living growth and in symbiosis. Depletion of the essential gene fcrX led to abnormally high levels of FtsZ and CtrA and minicell formation. Using multiple complementary techniques, we showed that FcrX is able to interact physically with FtsZ and CtrA. Moreover, its transcription is controlled by CtrA itself and displays an oscillatory pattern in the cell cycle. We further showed that, despite a weak homology with FliJ-like proteins, only FcrX proteins from closely-related species are able to complement S. meliloti fcrX function. Finally, deregulation of FcrX showed abnormal symbiotic behaviors in plants suggesting a putative role of this factor during bacteroid differentiation. In conclusion, FcrX is the first known cell cycle regulator that acts directly on both, CtrA and FtsZ, thereby controlling cell cycle, division and symbiotic differentiation.