Human breast tumours are diverse in their natural history and in their responsiveness to treatments1. Variation in transcriptional programs accounts for much of the biological diversity of human cells and tumours. In each cell, signal transduction and regulatory systems transduce information from the cell's identity to its environmental status, thereby controlling the level of expression of every gene in the genome. Here we have characterized variation in gene expression patterns in a set of 65 surgical specimens of human breast tumours from 42 different individuals, using complementary DNA microarrays representing 8,102 human genes. These patterns provided a distinctive molecular portrait of each tumour. Twenty of the tumours were sampled twice, before and after a 16-week course of doxorubicin chemotherapy, and two tumours were paired with a lymph node metastasis from the same patient. Gene expression patterns in two tumour samples from the same individual were almost always more similar to each other than either was to any other sample. Sets of co-expressed genes were identified for which variation in messenger RNA levels could be related to specific features of physiological variation. The tumours could be classified into subtypes distinguished by pervasive differences in their gene expression patterns.

Abstract Purpose: Expression profiling studies classified breast carcinomas into estrogen receptor (ER)+/luminal, normal breast-like, HER2 overexpressing, and basal-like groups, with the latter two associated with poor outcomes. Currently, there exist clinical assays that identify ER+/luminal and HER2-overexpressing tumors, and we sought to develop a clinical assay for breast basal-like tumors. Experimental Design: To identify an immunohistochemical profile for breast basal-like tumors, we collected a series of known basal-like tumors and tested them for protein patterns that are characteristic of this subtype. Next, we examined the significance of these protein patterns using tissue microarrays and evaluated the prognostic significance of these findings. Results: Using a panel of 21 basal-like tumors, which was determined using gene expression profiles, we saw that this subtype was typically immunohistochemically negative for estrogen receptor and HER2 but positive for basal cytokeratins, HER1, and/or c-KIT. Using breast carcinoma tissue microarrays representing 930 patients with 17.4-year mean follow-up, basal cytokeratin expression was associated with low disease-specific survival. HER1 expression was observed in 54% of cases positive for basal cytokeratins (versus 11% of negative cases) and was associated with poor survival independent of nodal status and size. c-KIT expression was more common in basal-like tumors than in other breast cancers but did not influence prognosis. Conclusions: A panel of four antibodies (ER, HER1, HER2, and cytokeratin 5/6) can accurately identify basal-like tumors using standard available clinical tools and shows high specificity. These studies show that many basal-like tumors express HER1, which suggests candidate drugs for evaluation in these patients.

Purpose EZH2 is a member of the polycomb group of genes and important in cell cycle regulation. Increased expression of EZH2 has been associated previously with invasive growth and aggressive clinical behavior in prostate and breast cancer, but the relationship with tumor cell proliferation has not been examined in human tumors. The purpose of this study was to validate previous findings in a population-based setting, also including tumors that have not been studied previously. Patients and Methods In our study of nearly 700 patients, we examined EZH2 expression and its association with tumor cell proliferation and other tumor markers, clinical features, and prognosis in cutaneous melanoma and cancers of the endometrium, prostate, and breast. Results Strong EZH2 expression was associated with increased tumor cell proliferation in all four cancer types. Associations were also found between EZH2 and important clinicopathologic variables. EZH2 expression showed significant prognostic impact in melanoma, prostate, and endometrial carcinoma in univariate survival analyses, and revealed independent prognostic importance in carcinoma of the endometrium and prostate. Conclusion Our findings point at EZH2 as a novel and independent prognostic marker in endometrial cancer, and validate previous findings on prostate and breast cancer. Further, EZH2 expression was associated with features of aggressive cutaneous melanoma. The fact that EZH2 might identify increased tumor cell proliferation and aggressive subgroups in several cancers may be of practical interest because the polycomb group proteins have been suggested as candidates for targeted therapy. EZH2 expression should, therefore, be further examined as a possible predictive factor.

Cervical cancer is responsible for 10-15% of cancer-related deaths in women worldwide. The aetiological role of infection with high-risk human papilloma viruses (HPVs) in cervical carcinomas is well established. Previous studies have also implicated somatic mutations in PIK3CA, PTEN, TP53, STK11 and KRAS as well as several copy-number alterations in the pathogenesis of cervical carcinomas. Here we report whole-exome sequencing analysis of 115 cervical carcinoma-normal paired samples, transcriptome sequencing of 79 cases and whole-genome sequencing of 14 tumour-normal pairs. Previously unknown somatic mutations in 79 primary squamous cell carcinomas include recurrent E322K substitutions in the MAPK1 gene (8%), inactivating mutations in the HLA-B gene (9%), and mutations in EP300 (16%), FBXW7 (15%), NFE2L2 (4%), TP53 (5%) and ERBB2 (6%). We also observe somatic ELF3 (13%) and CBFB (8%) mutations in 24 adenocarcinomas. Squamous cell carcinomas have higher frequencies of somatic nucleotide substitutions occurring at cytosines preceded by thymines (Tp*C sites) than adenocarcinomas. Gene expression levels at HPV integration sites were statistically significantly higher in tumours with HPV integration compared with expression of the same genes in tumours without viral integration at the same site. These data demonstrate several recurrent genomic alterations in cervical carcinomas that suggest new strategies to combat this disease.

Metastasis underlies the majority of cancer-related deaths. Thus, furthering our understanding of the molecular mechanisms that enable tumor cell dissemination is a vital health issue. Epithelial-to-mesenchymal transitions (EMTs) endow carcinoma cells with enhanced migratory and survival attributes that facilitate malignant progression. Characterization of EMT effectors is likely to yield new insights into metastasis and novel avenues for treatment. We show that the presence of the receptor tyrosine kinase Axl in primary breast cancers independently predicts strongly reduced overall patient survival, and that matched patient metastatic lesions show enhanced Axl expression. We demonstrate that Axl is strongly induced by EMT in immortalized mammary epithelial cells that establishes an autocrine signaling loop with its ligand, Gas6. Epiallelic RNA interference analysis in metastatic breast cancer cells delineated a distinct threshold of Axl expression for mesenchymal-like in vitro cell invasiveness and formation of tumors in foreign and tissue-engineered microenvironments in vivo. Importantly, in two different optical imaging-based experimental breast cancer models, Axl knockdown completely prevented the spread of highly metastatic breast carcinoma cells from the mammary gland to lymph nodes and several major organs and increased overall survival. These findings suggest that Axl represents a downstream effector of the tumor cell EMT that is required for breast cancer metastasis. Thus, the detection and targeted treatment of Axl-expressing tumors represents an important new therapeutic strategy for breast cancer.

Abstract Purpose: Cell adhesion molecules are of crucial importance in cancer invasion and metastasis. Epithelial to mesenchymal transition, characterized by reduced E-cadherin and increased N-cadherin expression, has been recognized as a feature of aggressive tumors, but the importance of this phenotype has not been settled in human prostate cancer. We here present novel data, with special focus on the independent relationship between an E-cadherin to N-cadherin switch (EN-switch) and patient prognosis. Experimental Design: Tissue microarray sections from a consecutive series of 104 radical prostatectomies during 1988 to 1994 with detailed clinicopathologic data and long follow-up were studied immunohistochemically for the expression of E-cadherin, N-cadherin, P-cadherin, β-catenin, and p120CTN. Results: Low E-cadherin expression was significantly associated with adverse clinicopathologic features, whereas other biomarkers were mostly related to Gleason score. In univariate survival analyses, cadherin switching (high N-cadherin and low E-cadherin) showed strong and significant associations with multiple end points of progression and cancer-specific death. Expression of the “basal cell marker” P-cadherin was associated with shorter time to skeletal metastasis (P = 0.036). In multivariate analysis of time to clinical recurrence, the “EN-switch” (hazard ratio, 4.3; P < 0.0005) had strong and independent prognostic effect, together with Gleason score. Conclusion: These novel data unravel the importance of epithelial to mesenchymal transition for prostate cancer progression, and demonstration of a switch from E-cadherin to N-cadherin expression could have significant effect on the care of prostate cancer patients.

Abstract Purpose: Triple-negative (TN; estrogen receptor, progesterone receptor, and HER-2 negative) cancer and basal-like breast cancer (BLBC) are associated with poor outcome and lack the benefit of targeted therapy. It is widely perceived that BLBC and TN tumors are synonymous and BLBC can be defined using a TN definition without the need for the expression of basal markers. Experimental Design: We have used two well-defined cohorts of breast cancers with a large panel of biomarkers, BRCA1 mutation status, and follow-up data to compare the clinicopathologic and immunohistochemical features of TN tumors expressing one or more of the specific basal markers (CK5/6, CK17, CK14, and epidermal growth factor receptor; BLBC) with those TN tumors that express none of these markers (TN3BKE−). Results: Here, we show that although the morphologic features of BLBC are not significantly different from that of TN3BKE- tumors, BLBC showed distinct clinical and immunophenotypic differences. BLBC showed a statistically significant association with the expression of the hypoxia-associated factor (CA9), neuroendocrine markers, and other markers of poor prognosis such as p53. A difference in the expression of cell cycle-associated proteins and biomarkers involved in the immunologic portrait of tumors was seen. Compared with TN3BKE- tumors, BLBC was positively associated with BRCA1 mutation status and showed a unique pattern of distant metastasis, better response to chemotherapy, and shorter survival. Conclusion: TN breast cancers encompass a remarkably heterogeneous group of tumors. Expression of basal markers identifies a biologically and clinically distinct subgroup of TN tumors, justifying the use of basal markers (in TN tumors) to define BLBC.

Background: Microscopic human cancers can remain dormant for life. Tumor progression depends on sequential events, including a switch to the angiogenic phenotype, i.e., initial recruitment of new vessels. We previously demonstrated that human tumors contain tumor cell populations that are heterogeneous in angiogenic activity. Here, we separated angiogenic from nonangiogenic human tumor cell populations and compared their growth. Methods: Severe combined immunodeficient (SCID) mice were inoculated with nonangiogenic human MDA-MB-436 breast adenocarcinoma, KHOS-24OS osteosarcoma, or T98G glioblastoma cells. Most of the resulting tumors remained microscopic (<1 mm diameter), but some eventually became angiogenic and enlarged and were used to isolate angiogenic tumor cells. Angiogenic and nonangiogenic tumor cells were inoculated into SCID mice, and time to the development of palpable tumors was determined. Cell proliferation was assayed in vitro by growth curves and in vivo by staining for proliferating cell nuclear antigen or Ki67. Microscopic tumors from both tumor cell populations were examined for histologic evidence of vascular development 14 days after inoculation in mice. Expression of the angiogenesis inhibitor thrombospondin-1 was examined by immunoblotting. Results: Nonangiogenic tumors of each tumor type developed palpable tumors after means of 119 days (range: 53–185 days) for breast cancer, 238 days (184–291 days) for osteosarcoma, and 226 days (150–301 days) for glioblastoma. Angiogenic cells developed palpable tumors within 20 days after inoculation. However, nonangiogenic and angiogenic cells of each tumor type had similar proliferation rates. Fourteen days after tumor cell inoculation, tumors from angiogenic cells showed evidence of functional vasculature. In contrast, nonangiogenic tumors remained microscopic in size with absent or nonfunctional vasculature. Thrombospondin-1 expression was statistically significantly lower (by five- to 23-fold, depending on tumor type) in angiogenic than nonangiogenic cells. Conclusions: This model provides a conceptual framework and a reproducible in vivo system to study unresolved central questions in cancer biology regarding the initiation, reversibility, and molecular regulation of the timing of the angiogenic switch.

Basal-like breast cancer has been extensively characterized on the basis of gene expression profiles, but it is becoming increasingly common for these tumors to be defined on the basis of immunohistochemical (IHC) staining patterns, particularly in retrospective studies where material for expression profiling may not be available. The IHC pattern that best defines basal-like tumors is under investigation and various combinations of ER, PR, HER2-, CK5/6+ and EGFR+ have been tested. Using datasets from two different hospitals we describe how using different combinations of immunohistochemical patterns has different effects on estimating prognosis at different time intervals after diagnosis. As our baseline, we used two IHC patterns ER-/PR-/HER2-("triple negative phenotype", TNP) and ER-/HER2-/CK5/6+ and/or EGFR+ ("core basal phenotype", CBP). There was no overall difference in survival between the two hospital-based series, but there was a difference between the TNP and non-TNP groups which was most marked at 3 years (76.8% vs 93.5%, p < .0001). This difference reduced with time, suggesting that long term survivors (beyond 10 years) in the TNP group may have comparable survival to non-TNP cases. A similar difference was seen if CBP was used instead of TNP. However when CK5/6 and/or EGFR expressing tumors were analyzed without consideration of ER/PR status, the reduction in survival increased with time, becoming more pronounced at 10 years than at 3 years. Our findings suggests that CK5/6 and/or EGFR expressing tumor types have a persistently poorer prognosis over the longer term, an observation that may have important therapeutic implications as drugs that target the EGFR are currently being evaluated in breast cancer.