Summary Bacteria must balance the different needs for substrate assimilation, growth functions, and resilience in order to thrive in their environment. Of all cellular macromolecules, the bacterial proteome is by far the most important resource and its size is limited. Here, we investigated how the highly versatile ‘knallgas’ bacterium Cupriavidus necator reallocates protein resources when grown on different limiting substrates and with different growth rates. We determined protein quantity by mass spectrometry and estimated enzyme utilization by resource balance analysis modeling. We found that C. necator invests a large fraction of its proteome in functions that are hardly utilized. Of the enzymes that are utilized, many are present in excess abundance. One prominent example is the strong expression of CBB cycle genes such as Rubisco during growth on fructose. Modeling and mutant competition experiments suggest that CO 2 -reassimilation through Rubisco does not provide a fitness benefit for heterotrophic growth, but is rather an investment in readiness for autotrophy. Highlights A large fraction of the C. necator proteome is not utilized and not essential Highly utilized enzymes are more abundant and less variable Autotrophy related enzymes are largely underutilized Re-assimilation of CO 2 via the CBB cycle is unlikely to provide a fitness benefit

Abstract SARS-CoV-2 infection and COVID-19 disease vary with respect to viral variant and host vaccination status. However, how vaccines, emergent variants, and their intersection shift host responses in the human nasal mucosa remains uncharacterized. We and others have shown during the first SARS-CoV-2 wave that a muted nasal epithelial interferon response at the site of infection underlies severe COVID-19. We sought to further understand how upper airway cell subsets and states associate with COVID-19 phenotypes across viral variants and vaccination. Here, we integrated new single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data from nasopharyngeal swabs collected from 67 adult participants during the Delta and Omicron waves with data from 45 participants collected during the original (Ancestral) wave in our prior study. By characterizing detailed cellular states during infection, we identified changes in epithelial and immune cells that are both unique and shared across variants and vaccination status. By defining SARS-CoV-2 RNA+ cells for each variant, we found that Delta samples had a marked increase in the abundance of viral RNA+ cells. Despite this dramatic increase in viral RNA+ cells in Delta cases, the nasal cellular compositions of Delta and Omicron exhibit greater similarity, driven partly by myeloid subsets, than the Ancestral landscapes associated with specialized epithelial subsets. We found that vaccination prior to infection was surprisingly associated with nasal macrophage recruitment and activation rather than adaptive immune cell signatures. While patients with severe disease caused by Ancestral or Delta variants had muted interferon responses, Omicron-infected patients had equivalent interferon responses regardless of disease severity. Our study defines the evolution of cellular targets and signatures of disease severity in the upper respiratory tract across SARS-CoV-2 variants, and suggests that intramuscular vaccines shape myeloid responses in the nasal mucosa upon SARS-CoV-2 infection.

Genetic code expansion via stop codon suppression is a powerful strategy to engineer proteins. Suppressor tRNAs are aminoacylated with noncanonical amino acids (ncAAs) by dedicated aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) and direct ncAA incorporation site-specifically during translation. These pairs of tRNA/aaRS must be orthogonal to the host9s tRNAs, aaRS and natural amino acids. Pyrrolysyl-tRNA (PylT)/PylRS pairs from methanogenic archaea, as well as engineered tRNA/aaRS pairs derived from bacteria, are used for genetic code expansion in mammalian cells. Amber suppression is routinely achieved by transient introduction of the components leading to short-term and heterogeneous expression. Here, we demonstrate that stable integration of tRNA/aaRS genes allows for efficient, genetically encoded ncAA incorporation in diverse mammalian cell lines. We extend a general plasmid design and PiggyBac (PB) integration strategy developed for the Methanosarcina mazei PylT/PylRS pair to genomic integration of two tRNA/aaRS pairs of bacterial origin. We further explore suppression of ochre and opal stop codons and parallel incorporation of two distinct ncAAs, both accessible for click chemistry, by dual suppression in stable cell lines. Clonal selection allows for isolation of cells with high dual suppression efficiency and dual site-specific fluorescent labeling of a cell surface receptor using bioorthogonal click chemistries on live mammalian cells.