The mitogen-activated protein kinases (MAP kinases) p42mapk and p44mapk are serine/threonine kinases rapidly activated in cells stimulated with various extracellular signals by dual phosphorylation of tyrosine and threonine residues. They are thought to play a pivotal role in integrating and transmitting transmembrane signals required for growth and differentiation. Here we demonstrate that activation of these ubiquitously expressed MAP kinases is essential for growth. To specifically suppress MAP kinase activation in fibroblasts, we transiently expressed either the entire p44mapk antisense RNA or p44mapk kinase-deficient mutants (T192A or Y194F). As expected, and through independent mechanisms, both approaches strongly inhibited MAP kinase activation. The antisense reduced the expression of endogenous p42mapk and p44mapk by 90%, whereas overexpression of the T192A mutant inhibited growth factor activation of both endogenous MAP kinases by up to 70%. As a consequence, we found that the antisense as well as the T192A mutant of p44mapk inhibited growth factor-stimulated gene transcription (collagenase promoter assay with chloramphenicol acetyltransferase reporter) and cell growth. These effects were proportional to the extent of MAP kinase inhibition and reversed by coexpression of the wild-type p44mapk. Therefore we conclude that growth factor activation of p42mapk and p44mapk is an absolute requirement for triggering the proliferative response.

Pluripotent embryonic stem (ES) cells must select between alternative fates of self-replication and lineage commitment during continuous proliferation. Here, we delineate the role of autocrine production of fibroblast growth factor 4 (Fgf4) and associated activation of the Erk1/2 (Mapk3/1) signalling cascade. Fgf4 is the major stimulus activating Erk in mouse ES cells. Interference with FGF or Erk activity using chemical inhibitors or genetic ablations does not impede propagation of undifferentiated ES cells. Instead,such manipulations restrict the ability of ES cells to commit to differentiation. ES cells lacking Fgf4 or treated with FGF receptor inhibitors resist neural and mesodermal induction, and are refractory to BMP-induced non-neural differentiation. Lineage commitment potential of Fgf4-null cells is restored by provision of FGF protein. Thus, FGF enables rather than antagonises the differentiation activity of BMP. The key downstream role of Erk signalling is revealed by examination of Erk2-null ES cells,which fail to undergo either neural or mesodermal differentiation in adherent culture, and retain expression of pluripotency markers Oct4, Nanog and Rex1. These findings establish that Fgf4 stimulation of Erk1/2 is an autoinductive stimulus for naïve ES cells to exit the self-renewal programme. We propose that the Erk cascade directs transition to a state that is responsive to inductive cues for germ layer segregation. Consideration of Erk signalling as a primary trigger that potentiates lineage commitment provides a context for reconciling disparate views on the contribution of FGF and BMP pathways during germ layer specification in vertebrate embryos.

Abstract Despite its importance in human cancers, including colorectal cancers (CRC), oncogenic KRAS has been extremely challenging to target therapeutically. To identify potential vulnerabilities in KRAS-mutated CRC, we characterize the impact of oncogenic KRAS on the cell surface of intestinal epithelial cells. Here we show that oncogenic KRAS alters the expression of a myriad of cell-surface proteins implicated in diverse biological functions, and identify many potential surface-accessible therapeutic targets. Cell surface-based loss-of-function screens reveal that ATP7A, a copper-exporter upregulated by mutant KRAS, is essential for neoplastic growth. ATP7A is upregulated at the surface of KRAS-mutated CRC, and protects cells from excess copper-ion toxicity. We find that KRAS-mutated cells acquire copper via a non-canonical mechanism involving macropinocytosis, which appears to be required to support their growth. Together, these results indicate that copper bioavailability is a KRAS-selective vulnerability that could be exploited for the treatment of KRAS-mutated neoplasms.

ERK3/MAPK6 activates MAP kinase-activated protein kinase (MK)-5 in selected cell types. Male MK5 haplodeficient mice show reduced hypertrophy and attenuated increase in Col1a1 mRNA in response to increased cardiac afterload. In addition, MK5 deficiency impairs cardiac fibroblast function. This study determined the effect of reduced ERK3 on cardiac hypertrophy following transverse aortic constriction (TAC) and fibroblast biology in male mice. Three weeks post-surgery, ERK3, but not ERK4 or p38α, co-immunoprecipitated with MK5 from both sham and TAC heart lysates. The increase in left ventricular mass and myocyte diameter was lower in TAC-ERK3

ERK3/MAPK6 (MAPK6 gene) along with its paralog ERK4/MAPK4 (MAPK4 gene) define a distinct subfamily of atypical mitogen-activated protein kinases (MAPKs). Much remains to be learned about the substrates and biological functions of these signaling enzymes. Interestingly, recent work has suggested that ERK4 promotes prostate cancer progression via the non-canonical activation of AKT/mTOR signaling. In their recent study, Wang et al. report that ERK4 is expressed in a subset of triple-negative breast cancer (TNBC) cell lines and that this expression is critical for AKT activation and for sustaining TNBC cell proliferation in vitro and tumor growth in mice. They also show that depletion of ERK4 sensitizes TNBC cells to phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) inhibitors. They conclude that ERK4 is a promising therapeutic target for TNBC and has potential for combination therapy with PI3K inhibitors. Here, we raise concerns about the cellular models and experimental approaches used in this study, which compromises the conclusions on the oncogenic role of ERK4 in TNBC.

ABSTRACT Metastasis, the process by which cancer cells colonize distant organs, relies on the ability of these cells to migrate and invade the surrounding tissues. The ezrin, radixin, and moesin family (ERM) of proteins are critical regulators of cell morphology transformations required for cancer cell movement and invasion. Yet, how ERMs are activated during metastasis remains poorly understood. Here, we identified the thromboxane A2 receptor (TBXA2R), a G protein-coupled receptor, as a critical activator of ERMs that promotes motility, invasion, and metastasis of triple-negative breast cancer (TNBC) cells. We found that ERM activation downstream of TBXA2R signaling depends on the Gα q/11 and Gα 12/13 subfamilies, the small GTPase RhoA, and its Ser/Thr kinase effector SLK. We also showed that TBXA2R signaling increases TNBC cell motility and invasion in vitro and metastasis in vivo, depending on ERMs. These findings unveil a novel mechanism by which a member of the largest class of receptors activates key metastatic determinants to promote TNBC metastasis, which could have important implications for developing novel therapeutic strategies.

The physiological functions of the atypical MAP kinase ERK3 remain poorly characterized. Previous analysis of mice with a targeted insertion of the lacZ reporter in the Mapk6 locus (Mapk6lacZ) showed that inactivation of ERK3 in Mapk6lacZ mice leads to perinatal lethality associated with intrauterine growth restriction, defective lung maturation, and neuromuscular anomalies. To further explore the role of ERK3 in physiology and disease, we generated novel mouse models expressing a catalytically-inactive (Mapk6KD) or conditional (Mapk6D) allele of ERK3. Surprisingly, we found that mice devoid of ERK3 kinase activity or expression survive the perinatal period without any observable lung or neuromuscular phenotype. ERK3 mutant mice reached adulthood, were fertile and showed no apparent health problem. However, analysis of growth curves revealed that ERK3 kinase activity is ncessary for optimal post-natal growth. To gain insight into the genetic basis underlying the discrepancy in phenotypes of different Mapk6 mutant mouse models, we analyzed the regulation of genes flanking the Mapk6 locus by quantitative PCR. We found that expression of several Mapk6 neighboring genes is deregulated in Mapk6lacZ mice, but not in Mapk6KD or Mapk6D mutant mice. Our genetic analysis suggests that off-target effects of the targeting construct on local gene expression are likely to be responsible for the perinatal lethality phenotype of Mapk6lacZ mutant mice.

ABSTRACT ERK3/MAPK6, an atypical MAPK, activates MAP kinase-activated protein kinase (MK)-5 in selected cell types. MK5 haplodeficient mice show reduced hypertrophy and attenuated increase in Col1a1 mRNA in response to increased cardiac afterload. In addition, MK5 deficiency alters cardiac fibroblast function. This study was to determine the effect of reduced ERK3 on cardiac hypertrophy following transverse aortic constriction (TAC) and fibroblast biology. Three wk post-surgery, ERK3, but not ERK4 or p38α, was co-immunoprecipitated with MK5 from both sham and TAC heart lysates. The increase in left ventricular mass and myocyte diameter was lower in TAC-ERK3 +/- than TAC-ERK3 +/+ hearts, whereas ERK3 haploinsufficiency did not alter systolic or diastolic function. Furthermore, the TAC-induced increase in Col1a1 mRNA abundance was diminished in ERK3 +/- hearts. ERK3 immunoreactivity was detected in atrial and ventricular fibroblasts but not myocytes. In both quiescent fibroblasts and ‘activated’ myofibroblasts isolated from adult mouse heart, siRNA-mediated knockdown of ERK3 reduced the TGF-β-induced increase in Col1a1 mRNA. In addition, intracellular type 1 collagen immunoreactivity was reduced following ERK3 depletion in quiescent fibroblasts but not myofibroblasts. Finally, knocking down ERK3 impaired motility in both atrial and ventricular myofibroblasts. These results suggest that ERK3 plays an important role in multiple aspects of cardiac fibroblast biology.

Abstract Cytokinesis is the last step of cell division and is regulated by the small GTPase RhoA. RhoA activity is required for all steps of cytokinesis, including prior to abscission when daughter cells are ultimately physically separated. Like germ cells in all animals, the C. elegans embryonic germline founder cell initiates cytokinesis but does not complete abscission, leaving a stable intercellular bridge between the two daughter cells. Here we identify and characterize C. elegans OSGN-1 as a novel cytokinetic regulator that promotes RhoA activity during late cytokinesis. Sequence analyses and biochemical reconstitutions reveal that OSGN-1 is a flavin-containing monooxygenase. Genetic analyses indicate that the monooxygenase activity of OSGN-1 is required to maintain active RhoA at the end of cytokinesis in the germline founder cell and to stabilize the intercellular bridge. Deletion of OSGIN1 in human cells results in an increase in binucleation as a result of cytokinetic furrow regression, and this phenotype can be rescued by expressing a catalytically-active form of C. elegans OSGN-1, indicating that OSGN-1 and OSGIN1 are functional orthologs. We propose that OSGN-1 and OSGIN1 are novel, conserved monooxygenase enzymes required to maintain RhoA activity at the intercellular bridge during late cytokinesis and thus promote its stability, enabling proper abscission in human cells and bridge stabilization in C. elegans germ cells.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most prevalent primary liver malignancy and is a major cause of cancer-related mortality in the world. This study aimed to characterize glutamine amino acid transporter expression profiles in HCC compared to those of normal liver cells. In vitro and in vivo models of HCC were studied using qPCR, whereas the prognostic significance of glutamine transporter expression levels within patient tumors was analyzed through RNAseq. Solute carrier (SLC) 1A5 and SLC38A2 were targeted through siRNA or gamma-p-nitroanilide (GPNA). HCC cells depended on exogenous glutamine for optimal survival and growth. Murine HCC cells showed superior glutamine uptake rate than normal hepatocytes (p < 0.0001). HCC manifested a global reprogramming of glutamine transporters compared to normal liver: SLC38A3 levels decreased, whereas SLC38A1, SLC7A6, and SLC1A5 levels increased. Also, decreased SLC6A14 and SLC38A3 levels or increased SLC38A1, SLC7A6, and SLC1A5 levels predicted worse survival outcomes (all p < 0.05). Knockdown of SLC1A5 and/or SLC38A2 expression in human Huh7 and Hep3B HCC cells, as well as GPNA-mediated inhibition, significantly decreased the uptake of glutamine; combined SLC1A5 and SLC38A2 targeting had the most considerable impact (all p < 0.05). This study revealed glutamine transporter reprogramming as a novel hallmark of HCC and that such expression profiles are clinically significant.