Multiple chromosomal sites are readily labeled using Cas9 and guide RNAs that bind fluorescent proteins, enabling visualization of chromatin dynamics. A lack of techniques to image multiple genomic loci in living cells has limited our ability to investigate chromosome dynamics. Here we describe CRISPRainbow, a system for labeling DNA in living cells based on nuclease-dead (d) Cas9 combined with engineered single guide RNA (sgRNA) scaffolds that bind sets of fluorescent proteins. We demonstrate simultaneous imaging of up to six chromosomal loci in individual live cells and document large differences in the dynamic properties of different chromosomal loci.

Significance The detection of specific genes in fixed cells was first accomplished in 1969 by Gall and Pardue. The development of analogous methods applicable to living cells is now at hand. At the forefront of this advance (2013–2014), we and other investigators have used transcription activator-like effectors (TALEs) conjugated with fluorescent proteins to tag genomic loci in live cells. More recently, the CRISPR/Cas9 system has provided a more flexible approach to targeting specific loci. In this paper, we describe the labeling of human genomic loci in live cells with three orthogonal CRISPR/Cas9 components, allowing multicolor detection of genomic loci with high spatial resolution, which provides an avenue for barcoding elements of the human genome in the living state.

SUMMARY In contrast to the well-studied condensation and folding of chromosomes during mitosis, their dynamics in interphase are less understood. We developed a sensitive, multicolor system, CRISPR-Sirius, allowing the real-time tracking of the dynamics of chromosomal loci. We tracked loci kilobases to megabases apart and found significant variation in the inter-locus distances of each pair, indicating differing degrees of DNA contortion. We resolved two distinct modes of dynamics of loci: saltatory local movements as well as translational movements of the domain. The magnitude of both of these modes of movements increased from early to late G1, whereas the translational movements were reduced in early S. The local fluctuations decreased slightly in early S and more markedly in mid-late S. These newly observed movements and their cell cycle-dependence are indicative of a hitherto unrecognized compaction-relaxation dynamic of the chromosomal fiber operating concurrently with changes in the extent of observed genomic domain movements. IN BRIEF Distinct chromosome folding and dynamics during cell cycle progression were dissected by CRISPR-Sirius DNA imaging in living cells. HIGHLIGHTS CRISPR-Sirius allows tracking of pairs of chromosomal loci having kilobase to megabase inter-locus distances Pair-wise tracking of loci allows measurement of both local and domain dynamics Chromosomal fiber relaxation is positively correlated with local dynamics Genomic region size contributes to local and domain movements Distinct chromosome dynamics were uncovered during cell cycle progression in interphase

The nucleolus is a multi-functional nuclear body. To tease out the roles of nucleolar structure without resorting to multi-action drugs, we knocked down RNA polymerase I subunit RPA194 in HeLa cells by siRNA. Loss of RPA194 resulted in nucleolar structural segregation and effects on both nucleolus-proximal and distal nuclear components. The perinucleolar compartment was disrupted, centromere-nucleolus interactions were significantly reduced, and the intranuclear locations of specific genomic loci were altered. Moreover, Cajal bodies, distal from nucleoli, underwent morphological and compositional changes. To distinguish whether these global reorganizations are the results of nucleolar structural disruption or inhibition of ribosome synthesis, the pre-ribosomal RNA processing factor, UTP4, was also knocked down, which did not lead to nucleolar segregation, nor the intranuclear effects seen with RPA195A knockdown, demonstrating that they do not arise from a cessation of ribosome synthesis. These findings point to a commutative system that links nucleolar structure to the maintenance and spatial organization of certain nuclear bodies and genomic loci.

Abstract Despite the long-observed correlation between H3K9me3, chromatin architecture and transcriptional repression, how H3K9me3 regulates genome higher-order organization and transcriptional activity in living cells remains unclear. Here we develop EpiGo ( E pigenetic p erturbation i nduced G enome o rganization)-KRAB to introduce H3K9me3 at hundreds of loci spanning megabases on human chromosome 19 and simultaneously track genome organization. EpiGo-KRAB is sufficient to induce de novo heterochromatin-like domain formation, which requires SETDB1, a methyltransferase of H3K9me3. Unexpectedly, EpiGo-KRAB induced heterochromatin-like domain does not result in widespread gene repression except a small set of genes with concurrent loss of H3K4me3 and H3K27ac. Ectopic H3K9me3 appears to spread in inactive regions but is largely restricted to transcriptional initiation sites in active regions. Finally, Hi-C analysis showed that EpiGo-KRAB induced to reshape existing compartments. These results reveal the role of H3K9me3 in genome organization could be partially separated from its function in gene repression.

We here describe a technique termed STRIDE (SensiTive Recognition of Individual DNA Ends), which enables highly sensitive, specific, direct in situ detection of single- or double-strand DNA breaks (sSTRIDE or dSTRIDE), in nuclei of single cells, using fluorescence microscopy. Sensitivity of STRIDE was tested using specially developed CRISPR/Cas9 DNA damage induction system, capable of inducing small clusters or individual single- or double-strand breaks. STRIDE exhibits significantly higher sensitivity and specificity of detection of DNA breaks than the commonly used TUNEL assay or methods based on monitoring of recruitment of repair proteins or histone modifications at the damage site (e.g. γH2AX). Even individual genome site-specific DNA double-strand cuts induced by CRISPR/Cas9, as well as individual single-strand DNA scissions induced by the nickase version of Cas9, can be detected by STRIDE and precisely localized within the cell nucleus. We further show that STRIDE can detect low-level spontaneous DNA damage, including age-related DNA lesions, DNA breaks induced by several agents (bleomycin, doxorubicin, topotecan, hydrogen peroxide, UV, photosensitized reactions), and fragmentation of DNA in human spermatozoa. STRIDE methods are potentially useful in studies of mechanisms of DNA damage induction and repair in cell lines and primary cultures, including cells with impaired repair mechanisms.

Epigenetic modifications play an essential role in chromatin architecture and dynamics. The role of epigenetic modification in chromatin organization has been studied by Hi-C from population cells, but imaging techniques to study their correlation and regulation in single living cells are lacking. Here we develop a CRISPR-based EpiGo (Epigenetic perturbation induced Genome organization) system to track epigenetic modification-mediated relocation, interaction or reorganization of genomic regions in living cells. EpiGo-KRAB is sufficient to induce the relocation of genomic loci to HP1alpha; condensates and trigger genomic interactions. EpiGo-KRAB also triggers the induction of H3K9me3 at large genomic regions, which decorate on the surface of HP1alpha; condensates possibly driven by phase separation.