Abstract Across cancers, tumor cells can resemble embryonic cell states that may allow them to metastasize and evade therapies. Melanoma is a cancer of the melanocyte that exhibits a wide range of transcriptional states characterized by alterations in embryonic melanocyte gene expression patterns. How these states and their functions are related to the embryonic precursors of melanocytes, the melanoblasts, is unknown. Here, we present the first high-resolution single-cell RNA-seq profiles of embryonic melanocytic lineages in mice. We discover a diverse array of transcriptional cell states in this lineage and confirm, for the first time at the single-cell level, that melanocytes arise from Schwann-cell precursors (SCPs), a highly plastic cell population, via a newly described intermediate mesenchymal-like state. Via novel computational strategies to map these developmental cell states to metastatic melanoma, we find that SCP-resembling tumors are associated with exclusion of the immune cells and non-response to immune checkpoint blockade. In contrast, a higher mesenchymal profile underlies immune dysfunction and resistance to BRAF-inhibition therapy. We also carry out the first time-resolved single-cell RNA-seq study of early melanoma metastatic colonization, demonstrating that melanoma cells activate a SCP program transiently during early metastatic colonization. Finally, we discover a hybrid lineage state that resembles multiple melanocytic lineages simultaneously and is enriched in melanoma cells during metastatic seeding and in therapy resistance. Our work reveals that the lineage-specific mechanisms underlie melanoma progression/evolution, including early metastatic colonization and therapeutic resistance.

Intratumoral heterogeneity (ITH) can promote cancer progression and treatment failure, but the complexity of the regulatory programs and contextual factors involved complicates its study. To understand the specific contribution of ITH to immune checkpoint blockade (ICB) response, we generated single cell-derived clonal sublines from an ICB-sensitive and genetically and phenotypically heterogeneous mouse melanoma model, M4. Genomic and single cell transcriptomic analyses uncovered the diversity of the sublines and evidenced their plasticity. Moreover, a wide range of tumor growth kinetics were observed in vivo , in part associated with mutational profiles and dependent on T cell-response. Further inquiry into melanoma differentiation states and tumor microenvironment (TME) subtypes of untreated tumors from the clonal sublines demonstrated correlations between highly inflamed and differentiated phenotypes with the response to anti-CTLA-4 treatment. Our results demonstrate that M4 sublines generate intratumoral heterogeneity at both levels of intrinsic differentiation status and extrinsic TME profiles, thereby impacting tumor evolution during therapeutic treatment. These clonal sublines proved to be a valuable resource to study the complex determinants of response to ICB, and specifically the role of melanoma plasticity in immune evasion mechanisms.

Despite promising results with immune checkpoint blockade (ICB) therapy, outcomes of patients with brain metastasis (BrM) remain poor. Identifying determinant of resistance is crucial but has been hindered by limited access to patient samples and the scarcity of relevant preclinical models. Here, we developed two mouse melanoma BrM models that mirror the disparate response to ICB seen in patients. By characterizing their mutational landscape and performing single-cell phenotypic and transcriptomic analysis, we demonstrated that these models recapitulate both the cellular and molecular features of human disease. Through our comparative analysis, we identified key factors contributing to ICB response. In the responsive model, we found that tumor cells expressed inflammatory programs that polarized microglia toward reactive states, expressing high levels of MHC-I and -II and immunostimulatory molecules, eliciting robust T cell recruitment and activation, which favored anti-tumor immunity. Conversely, the resistant melanoma cells were characterized by neurological molecular signatures and expression of ligands that maintain microglia homeostatic states, resulting in poor T cell infiltration and therapy resistance. We validated our findings in BrM patients, showing that BR1 and BR3 signatures correlated with T cell infiltration and were associated with better and worse patient outcomes, respectively. Our study fills a critical gap by providing clinically relevant models and revealing mechanistic insights into BrM ICB responses, identifying potential biomarkers and therapeutic targets.